백일해 번역(한국어 원본)기존 백일해 무독화 시험에서 사용되었던 마우스모델보다 더 큰 히스타민 민감성을 갖는 마우스모델을 개발하기 위하여, 우리는 6개의 마우스종, 성별, 주령을 달리하여 총 36개의 그룹으로 나누어 50ng의 백일해독소를 복강주사한 후, 4일 후에 2mg의 히스타민을 복강주사하여 30분 후의 마우스직장체온과 그 사망수를 동시에 확인하였다. 음성대조군으로서 saline을 주사하고, 4일 후에 2mg의 히스타민을 복강주사 하였으며, 양성대조군으로서 0.4 HSU/dose의 국가표준품인 (06/016)을 복강주사하고, 4일 후에 같은 농도의 히스타민을 복강주사하였다. Table 2를 보는 바와 같이, 마우스사망종말법의 경우 백일해독소에 민감한 마우스종은 CD1과 C57/BL6와 ddY 종이었으며, 가장 히스타민에 민감한 군은 CD1 8주령 수컷군과 ddY 8주령 수컷군에서 가장 높은 히스타민민감도를 확인할 수 있었다. 반면에 C3H/HeN, Balb/c, DBA/2의 경우 백일해독소에의한 히스타민민감도가 매우 낮은 것을 확인할 수 있었으며, 음성대조군에서는 사망한 마우스가 없었다. 직장체온법으로 확인한 결과, 마우스사망종말법과 같은 양상의 결과를 보였으며, 음성대조군을 포함한 모든 동물군의 모든 시험군에서 주령에 따라 히스타민에 의하여 체온이 감소하는 경향을 보였다.
CD1 mice에 대한 히스타민특징을 살펴보기 위하여, 2mg의 히스타민만 주사 한 후의 직장체온의 변화를 살펴보았다. 군당 총 20마리의 마우스를 사용하였으며 모든 마우스군에서 죽은 마우스는 없었다. Fig. 1(A)에서 보듯이, 히스타민만을 복강 투여한 군에서 마우스 주령에 따라 온도가 낮아지는 경향을 확인할 수 있었으며, 암컷에 비하여 수컷에서 더욱 낮아지는 것을 확인하였다. 다음은 히스타민 민감성이 매우 높은 8주령 수컷 CD1에서의 히스타민 량에 따른 민감도를 확인하기 위하여 4mg에서 0.5mg까지의 히스타민을 0.2mL의 volume으로 하여 복강주사를 하여 15분마다 직장체온을 측정하였다. Fig. 1(B)에서 보는 바와 같이 시간에 따라 온도가 낮아지다가 회복하는 양상을 보였으며, 히스타민의 양에 따라 체온감소폭이 크고, 회복하는 시간이 느려지는 패턴을 확인하였다. 0.5mg과 1mg의 히스타민의 경우, 15분전까지는 히스타민에 의해서 체온이 급격히 떨어지다가 이내 온도가 회복되는 경향을 보였으며, 2mg과 4mg에서 보듯이 히스타민의 농도가 높을수록 히스타민자체에 대한 체온회복시간이 더 걸리는 것을 확인할 수가 있었다. 이는 직장체온법의 경우 백일해무독화 시험의 적용할 때, 히스타민의 양과 측정시간에 대한 고려가 우선적으로 선행되어야 한다는 것을 보여주는 결과이며, 이에 따라 이후 시험에서는 직장체온법의 경우 0.5mg의 히스타민을 사용하였다. 사망종말점의 경우 50ng의 백일해 독소를 투여한 후 4일 후에 0.5mg의 히스타민복강주사를 수행하여도 50% 미만의 사망률을 보여서 2mg의 히스타민을 사용하기로 하였다(data not shown). 또한 CD1 mice에 대한 national reference (06/016)의 히스타민 특징을 살펴보았다. Table 2에서 보듯이 0.4HSU/dose의 national reference (06/016)에서 50ng 백일해 독소보다 높은 체온감소율을 볼 수 있었고, 더욱이 CD1 8주령 수컷의 경우 죽은 마우스의 수가 (9마리)가 동일함에도 불구하고 평균온도의 차이가 나타났다. 06/016의 특성을 살펴보기 위하여 4주령 CD1 암컷과 8주령 CD1 수컷을 이용하여 50ng의 백일해독소와 0.4 HSU/dose의 reference vaccine을 복강주사하고, 4일 후에 2mg의 히스타민을 복강주사 하였다. 음성대조군으로서 saline을 처리한 후 4일 후에 2mg의 히스타민을 복강주사 하였다. Fig. 2(A)를 보듯이, CD1 4주령 암컷의 경우, 음성대조군과 비교하여 50ng의 백일해독소와 0.4 HSU/dose의 06/016을 각각 처리하였을 때 온도가 유의적으로 감소한 것을 확인할 수 있었다(p < 0.05, p< 0.005, respectively). 또한 CD1 8주령 수컷의 경우, 음성대조군과 비교하여 0.4 HSU/dose의 06/016을 처리한 군은 온도가 유의적으로 감소한 것을 확인한 반면에 (p < 0.05) 에서 50ng의 백일해독소군에서는 온도가 유의적으로 감소한 것을 확인하지 못했다. 이는 히스타민에 매우 민감한 마우스의 경우 백일해독소에 대한 마우스직장체온법을 적용할 때, false positive또는 false negative의 위험성을 배제할 수 없음을 보여주는 결과이며, 마우스직장체온법의 경우 히스타민에 덜 민감한 마우스를 선정하거나, 히스타민양을 적게 사용해야 함을 시사한다. 또한 06/016과 더불어 Japanese reference vaccine인 Lot3를 sample buffer에 처리하여 SDS-PAGE를 수행한 후,weestern blotting한 결과 두 reference 백신 모두에서 백일해독소를 확인할 수 있었으며(Fig. 2(B), lysis buffer (2% SDS, 4% 2-mecaptoethanol, 10% glycerol, 1 M Tris, pH 6.8)에 06/016와 Lot3, NIBSC 백일해 LOS 표준품을 각각 첨가 후, proteinase K을 첨가하여 단백질을 분해한 후 phenol 을 처리하여 추출하였다. Phenol phase에서 LOS (lipooligosaccharide)를 분리하여 SDS-PAGE 후 silver staining을 통해 백일해 LOS를 모두 확인하였다 (Fig. 2(C)). 결론적으로 국가표준품 06/016은 백일해 독소뿐만 아니라 백일해 LOS의 activity를 갖는 표준품임을 확인하였다. |
백일해 번역(영어 번역본)In order to find a histamine sensitive mouse model, we performed HIST with mice classified into 36 groups according to species, gender, and age in weeks (Table 1). Each group of 10 mice was intraperitoneally injected with 50ng of PTx (09/518, NIBSC, UK). Four days after the injection, they were intraperitoneally challenged with 2mg of histamine. After histamine challenge, we checked rectal temperature or mortality rate of the mouse for respective groups. Negative control groups were injected with saline and after 4 days were challenged with 2mg histamine. As shown in Table 2, histamine sensitizing groups by 50ng of PTx were CD1, C57/BL6, and ddY, inter alia 8-weeks-old male CD1 group and 8-weeks-old male ddY group were most sensitive to PTx. On the other hand, C3H/HeN, Balb/c, and DBA/2 groups showed very low histamine sensitivity to PTx. Also, no mouse died in any negative control groups. Interestingly, results of rectal temperature-based method steadily decreased with advancing weeks among almost all groups including the negative control groups. This result indicated that the histamine sensitivity steadily increase with advancing age regardless of PTx.
To further examine histamine sensitizing characteristics, we performed HIST based on rectal temperature according to gender and age in week on CD1 mice. Each group of 20 mice was inoculated with saline and after 4 days was intraperitoneally challenged with 2mg of histamine. As shown in Fig. 1(A), results of rectal temperature method on CD1 mice groups steadily decreased with advancing weeks. Furthermore, tendency was especially marked in male groups.
We also implemented HIST based on rectal temperature according to histamine dosage on 8-weeks-old male CD1 mice, which were highly sensitive to histamine by PTx. Each group of 20 mice was injected with saline and after 4 days was intraperitoneally challenged with varying histamine dosages from 0.5mg to 4mg. The rectal temperature of each mouse was measured immediately, and checked every 15 minutes for 1 hour. As shown in Fig. 1(B), results of rectal temperature decreased at first then recovered over time. Moreover, at higher histamine dosages, the results of rectal temperature significantly decreased and times for recovery took longer. This result indicated that histamine dosage and temperature measuring time must be considered first when applying HIST based on rectal temperature. In this study, we injected 0.5mg of histamine and subsequently measured rectal temperature after 30 min for HIST based on rectal temperature.
To compare results of two HIST assays and to examine HIST enhancement by LPS, we examined HIST based on rectal temperature or lethal end point according to PTx dosage on 8-weeks-old male CD1 mice. Each group of 10 mice was intraperitoneally injected with varying PTx dosages from 50ng to 1.6ng in 0.2mL volume by serial two-fold dilution. Four negative control groups of 10 mice with saline in the absence and presence of 5㎍ of LPS were also included. Four days after the injection, they were intraperitoneally challenged with 2mg of histamine (lethal end point) or 0.5mg of histamine (rectal temperature). Both experiments were repeated twice. Comparing HIST activities based on rectal temperature in the absence or presence of 5㎍ of LPS, average rectal temperature quantitatively decreased depending on PTx dosage (Fig 2(A)) and groups treated with PTx in the presence of LPS were more sensitive to PTx than groups treated with only PTx. Furthermore, considering the detection limit, groups treated with only PTx showed significant difference for 12.5ng PTx group (p < 0.05) and 25ng PTx group (p< 0.01) compared to the negative control group, while groups treated with PTx in the presence LPS showed significant difference for 6.25ng of PTx group (p > 0.005) compared to the negative control group. Similar to the HIST based on rectal temperature, we also obtained results for HIST assay based on lethal end point in the absence or presence of 5㎍ of LPS. Moreover, 12.5ng of PTx or 6.25ng of PTx can be detected on HIST based on lethal end point in the absence or presence of LPS, respectively. This result indicated that sensitivity of lethal end point assay is equivalent to that of rectal temperature assay on 8-weeks-old male CD1 mice.
When we examined whether two HIST results using PTx spiking Td vaccines were influenced differently from the results using only PTx, we did not observe any difference between PTx and PTx spiking Td vaccine in the absence and presence of LPS (data not shown). We determined that Td vaccine itself cannot influence the result of two HIST assays.
In order to evaluate the relationship between the two enhanced HIST developed in this study, Td vaccine added with 5 ㎍ of LPS was used to buffer for spiking of PTx. PTx with varying dosages were spiked to the vaccine and intraperitoneally injected at single human dose. 4 days later, 0.5mg of histamine was injected for temperature-based method or 2mg of histamine was injected for lethal end point method on mice groups of 10 mice, respectively.
HIST based on lethal end point was not able to detect PTx at very low PTx content (< 1.6ng). Similarly, no significant difference was observed for 0ng, 0.8ng, and 1.6ng of PT in the HIST based on rectal temperature. A fine correlation was found between two HIST assays. The regression coefficient was 0.8967 (p < 2.2 e-16), with the interval of 95% confidence from 0.8683 to 0.9188. This result indicated that lethal end point method shows a similar level of sensitivity compared to the temperature-based method. |
