생태 독성 평가의 새로운 패러다임 번역

생태 독성 평가의 새로운 패러다임 번역(한국어 원본)

최근 생태 독성 평가 분야에서는 화학물질에 대한 독성 반응을 nominal concentration으로 제시되어진 초기노출 조건과의 단순 비교만으로는 온전한 용량 반응관계를 설명할 수 없음을 인지하고 이를 개선하기 위한 이론적, 방법적 패러다임의 변화들이 시도되고 있다. 실제적으로 독성물질들이 생체내에서 독성 반응을 나타내기 위해서는 우선적으로 test system안에서의 흡착, 증발과 같은 손실과정을 거치고 생물체내로 들어가야하며, target site of action에 도달하기 전 distribution과 biotransformation과 같은 toxicokinetic process를 거쳐야 한다. 이러한 과정은 노출 농도를 nominal concentration으로 표기하는 방식이 독성 반응을 설명하기에 현실성이 매우 결여되어진 방향이며, 생물학적 활용성(bioavailability)를 고려하지 않은 결과를 도출 할 수 있음을 보여주는 것이다. 이러한 문제들을 보완하기 위해 독성반응을 분석할 때 생체내 농도(internal concentration)또는 화학물질의 활성도(chemical activity)를 고려할 수 있는 새로운 방법들을 개발하기 시작하였다. 화학물질을 고분자 물질에 용해시킨 뒤, 이를 dosing phase로 제공하여 미디어 내에서 물질의 활성도를 일정하게 유지시키는 passive dosing방법이 이러한 대체 시험 방법으로 최근 생태독성 분야에 적용 되고 있다. 특히, 수용해도가 낮은 소수성 유해물질에 대한 수계 생물종의 노출 실험에 passive dosing method가 최근 가장 많이 적용되고 있다

Gene expression은 외부의 effector들을 감지한 receptor들의 DNA와의 수용체 결합으로 촉진되어진 messenger RNA가 대응을 위한 단백질 분자의 합성 정보를 전달하기 위한 과정을 detection하는 것이다. 이러한 gene expression biomarker는 protein 또는 enzyme 의 활성이 생체내에서 나타나기 이전의 단계를 확인할 수 있는 매우 민감한 endpoint이다. 이러한 까닭에 생물체 내의 독성 반응 활성에 관여하는 실제적인 독성 농도의 정의는 매우 중요하다고 할 수 있다.
본 연구에서는 기존에 주로 사용하고 있는 nominal concentration을 기준으로 하여 spiking하는 방법과 chemical activity를 일정하게 유지해줄 수 있는 새로운 테크닉으로 passive dosing 방법을 비교하였다. Figure 1A 에서 보여지듯이, spiking method로 1회성 노출이 이루어진 경우에는 독성반응과 실제적인 관계가 있는 자유농도가 실험 시작과 동시에 급격하게 감소하였으며, 더욱이 노출 총 볼륨이 작을수록 손실율이 더 커져(Figure 1A), 같은 nominal concentration으로 동일한 용량의 생물종에 노출 시켰다 할지라도 시간별로 약 0.2 mg/L 정도 적은 농도로 생물종에게 제공되어진 것으로 나타났다. 이러한 차이는 Figure 2에서 gene expression이 총 노출 미디어 볼륨에 따라 발현 pattern이 크게 다르게 나타나는 것으로 반영되고 있다. 즉, spiking method를 이용할 경우 gene epxression은 노출 볼륨, 생물량, 노출 기간등과 같은 요소들의 불확실성을 제어하지 못한 결과를 도출하게 됨으로 용량-반응관계를 정량화하는 것이 어렵다는 것을 결과를 통해 알 수 있었다. 그러나, passive dosing method를 이용하여 동일한 농도로 노출을 시도한 결과 안정적으로 C. elegans에 동일한 자유농도가 지속적으로 제공되어 졌음을 확인 할 수 있었다. 이는 CP에 대한 PDMS와 미디어간의 분배평형이 기본이 되어 노출 총 볼륨이나, 생물량에 의해 손실되어질 수 있는 부분이 보완되었기 때문이다.
또한 passive dosing method의 노출 조건에서의 gene expression은 시간에 따라 일정한 기울기로 증가하는 결과를 보였음을 figure 3를 통해 알 수 있었다. 시간에 따른 증가 경향은 농도를 감소시켜 노출 시킨 경우에도 cyp35a2와 cyp35a3 gene 에서 변함없이 증가하고 있음을 확인할 수 있었다(figure 4). 단지, 노출 농도가 0.3mg/L의 CP에서 1/2, 1/5로 감소함에 따라서 증가 경향의 기울기가 약 35%, 65% 정도로 두 gene 모두에서 감소하였다. 즉, 안정적인 노출 조건이 제공되어지는 환경에서는 gene expression과 같은 분자수준의 민감한 biomarker의 독성 반응도 화학물질의 농도와 시간에 따른 용량-반응관계를 확인 할 수 있다는 것을 보여준 것이다.
기준이 된 0.3mg/L의 CP는 기존의 문헌들 상에서 C.elegans 에게 1/10EC50에 해당하는 용량으로 spiking method로 노출 시 24시간 까지 어떠한 육안으로 관찰되는 effect들이 없었다(ref). 그러나, passive dosing으로 일정한 자유농도가 지속적으로 유지되어 노출이 이루어지자, 노출 10시간 이후부터 C. elegans의 body에 특이적인 변형이 관찰되기 시작했다. Spporting data에서 제시한 바와 같이 노출 시작 10시간 이후부터body의 중간 부분이 α 모양으로 꼬이기 시작하더니 24시간이 지난뒤에는 배부분이 모두 터진 α의 형태로 죽었다. 이러한 현상은 gene expression의 시간에 따른 선형증가 현상과 함께 체내의 CP의 잔류량의 증가로 설명할 수 있다. 일반적으로 CP는 체내에서 cytochrome p450의 대사 과정을 통해 제거되어진다(ref). 그러나, passive dosing은 대사로 인해 제거되어지는 분량과 관계없이 지속적으로 자유 농도의 CP를 제공하게 되고 이는 체내에 CP의 잔류량을 지속적으로 증가시키는 결과를 가져온다. 이로 C. elegans는 cyp35a2와 cyp35a3를 이용한 물질 대사를 지속적으로 진행해야하며, 이것이 gene expression의 시간에 따른 증가로 반영되었다. 그러나, 본 연구 결과에서와 같이 노출이 10시간 이상 지속되어진 경우, C. elegans는 CP의 체내 수용능력에 포화상태가 되어 이는 body의 deformation이 변형되는 상위단계의 effect를 유도하게 되고, 최후에는 dead라는 최악의 상황에 이르게 되는 것이다.
Gene expression은 매우 민감한 종말점으로 생태환경을 평가 및 모니터링하는데 매우 좋은 biomarker이다. 그러나, 노출 초기에 민감하게 반응하는 gene expression은 노출 환경(미디어, 노출농도, 노출 기간, 생물량)에 따라 variation이 커졌다. Passive dosing method는 PDMS를 이용해 매체내 물질의 자유농도를 일정하게 유지시켜줌으로써 기존의 노출 방법(spiking method)보다 초기 시간에, 저농도로 물질의 용량과 독성간의 dose-response relationship을 정의할 수 있게 만들어주었다. 이러한 결과는 분자수준의 예민한 biomarker들을 이용하여 독성 평가를 실시함에 있어서 자유농도를 고려한 passive dosing method가 매우 promising한 새로운 노출 방법임을 보여주었다.

생태 독성 평가의 새로운 패러다임 번역(영어 번역본)

In the field of ecotoxicological evaluation, it has been recently recognized that simple comparison of toxicological response to chemicals and initial exposure conditions presented as nominal concentration cannot accurately describe the dose-response relationship. To address this problem, various changes in the theoretical and methodological paradigm are being attempted. In order for toxins to elicit toxicological response in the body, they must enter the organism through processes such as adsorption and evaporation, which involves decrease in the toxin concentration, and they must undergo toxicokinetic processes such as biodistribution and biotransformation prior to reaching the target site of action. These processes show that using nominal concentration as the exposure concentration is an unrealistic representation of toxicological response and may not take into the bioavailability of the toxins. In order to address these issues, researchers have devised new methods to take into account the internal concentration or chemical activity of the toxins. One of such alternative methods is passive dosing, which involves solubilizing toxin in polymeric material and providing it as a dosing phase to maintain chemical activity of the toxin within the media at a constant level. This method is now being applied to the field of ecotoxicology, and is the most frequently employed method for exposure of aquatic organisms to hydrophobic hazardous substances with low water solubility.

Gene expression biomarker detects the process by which the messenger RNA (mRNA), which is stimulated by the complex of DNAs with receptors that have detected external effectors, delivers information for synthesis of proteins for response to the effectors. Such biomarkers are highly sensitive end points that can be used to detect changes prior to protein or enzymatic activity in the organism. Due to this reason, the definition of actual toxin concentration involved in activation of toxicological response within the organism is very important.

In this study, we compared the conventional spiking method using nominal concentration as the reference and the new passive dosing method that can main chemical activity at a constant level. As shown in Figure 1A, single exposure by spiking method resulted in rapid decline in freely dissolved toxin concentration, which is directly related to toxicological response, from the onset of the experiment. Especially, lower volume led to larger loss (Figure 1A) such that even if same number of organisms were exposed to the same nominal concentration, about 0.2 mg/L less chemical was delivered per hour to the organisms with smaller volume. Such difference is reflected by large difference in the expression pattern that varies with total exposure medium volume (Figure 2). From these results, it was concluded that it is hard to quantify dose-response relationship using the spiking method as variables such as exposure volume, biomass, and expression duration are difficult to control using this method. However, exposure at constant concentration using the passive dosing method resulted in maintenance of freely dissolved concentration for C. elegans, which was enabled by the CP distribution equilibrium between the PDMS and the medium to neutralize the effect of different total exposure volume or biomass.

Also, gene expression increased linearly over time when C. elegans was exposed with the passive dosing method (Figure 3). This trend was continued to be observed in cyp35a2 and cyp35a3 genes even when the exposure concentration has been decreased (Figure 4); when exposure concentration was decreased from 0.3 mg/L of CP to 0.15 mg/L and 0.06 mg/L , slope of the positive trend for the two genes decreased by 35% and 65%, respectively. This result showed that under environment in which stable exposure is guaranteed, toxicological response of sensitive molecular-level biomarkers such as gene expression displayed concentration- and time-dependent dose-response relationship.

The reference value of 0.3 mg/L of CP corresponds to one-tenth of EC50 to C elegans according to previous literature, but no changes in C. elegans were visually observed with the spiking method at that concentration [REF]. However, when passive dosing was used to maintain the free concentration at 0.3 mg/L, abnormal deformations of the body of C. elegans were observed after 10 hours of exposure. As provided in the Supporting Data, after 10 hours of exposure, its body started twisting in the alpha-shape in the middle, and the organism died after 24 hours with the body exploded in the alpha-shape. Along with linear increase of gene expression over time, this phenomenon can be explained by the increased residual amount of CP inside the body. In general, CP is eliminated through metabolism of cytochrome p450. However, passive dosing constantly provides CP at the pre-determined freely dissolved concentration level regardless of how much CP has been eliminated, which leads to continued increase of residual CP in the body. As a result, C. elegans must continue metabolism using cyp35a2 and cyp35a3, leading to increased gene expression over time. However, when exposure has been continued for over 10 hours as in this study, CP saturates the capability of C. elegans to store inside the body, eliciting higher-level effect of body deformation and ultimately the death of the organism.

Gene expression is a very sensitive end point that is an excellent biomarker for evaluating and monitoring ecological environment. However, gene expression that responds sensitively to the early phase of exposure varied significantly with exposure environment such as the medium, exposure concentration, exposure duration, and biomass. Passive dosing method involved using PDMS to maintain the freely dissolved concentration of a substance within the medium, thereby allowing the definition of dose-response relationship between the amount of the substance with toxicity at an earlier time than that conventional spiking method. Results from our study suggests that the passive dosing method accounting for freely dissolved chemical concentration is a promising method for toxicological evaluation using sensitive biomarkers at the molecular level.