유리화동결 논문번역(한국어 원본)I. 서 론
돼지는 경제적인 동물이며 생명공학 연구에 널리 사용된다. 돼지의 경우 효율적인 냉동보존 테크닉이 필요하다. 본 연구는 액체 형태의 수퇘지 정액을 사용하여 독특한 특징을 분석하고 냉동 및 해동과정에서 수퇘지의 생리학적 메커니즘을 논의할 것이다. 따라서 이번 탐구는 최소 부피의 초소형 빨대를 개발하고 동시 온도강하 속도를 이용하여 유리화동결 작용 동안 빨대가 서로 다른 위치에 있어도 정액이 생존 할 수 있도록 설계했다. 이 방법이 실제에도 적용될 시 실온에서 유독성을 제공하는 항냉동제를 반드시 사용할 필요는 없으며 이를 통해 냉각 후 정액을 안전하게 또 편리하게 사용할 수 있다.
II. 이론적 배경
최근 공상과학에서 자주 소개되는 인간냉동기술의 가능성이 연구를 통해 대두되고 있다. 1970년대 이후 배아 냉동 기술이 발달하여 몇몇 포유동물류의 경우 냉동 및 해동이 가능하게 되었다. 실험 동물, 경제 동물 및 인간의 줄기세포, 제대혈, 적혈구, 정액, 난모세포, 배아 및 간 조직, 난소 조직, 고환조직, 지방조직 같은 체세포의 세포 및 조직 냉동이 성공을 거두었다. 세포의 냉동보존의 원리를 연구하는 동안 돼지 및 소의 정액이 실험전단계에서 사용되었고 동시에 인간 정액의 특징이 연구되었다. 2
이 과정에서 인간 및 소 정액의 냉동 방법은 잘 개발된 반면 돼지 정액의 냉동 방법은 발달되지 못했다. 1970년대 냉동된 수퇘지 정액 생식이 처음으로 성공하고 (Polge et al.) Huang et al은 2009년 46~56%의 정자운동성을 보고했다. 돼지의 해부구조 및 생리구조는 인간과 유사하다. 따라서 최근 돼지에 관한 연구는 인간의 인공 신장 제조를 위해 활발히 진행되고 있고 냉동된 수퇘지의 정액 분배는 중요한 사안이 되었다.
수퇘지 정액이 낮은 온도에 민감하기 대문에 액체 형태로 17℃ 냉장고에 보관되어서 2~일 내에 사용되어야 한다. 이러한 제약으로 인해 돼지 정액은 경제적 가치가 낮을 뿐만 아니라 품종 보존이나 돼지 변형의 향상 혹은 개발을 위한 학문적 기여도 낮다. 이전 연구에서 본 연구자는 냉동된 소 정액이 비록 정자 유동성과 생존 능력이 높아도 DNA 손상이 매우 크다고 보고했다. 돼지 정액을 직접 얼렸을 때 정자의 운동성은 8%에 불과했지만 DNA는 전혀 손상되지 않았다. 또한 연구 결과 돼지 정액은 온도와 항냉동제의 농도에 민감한 것으로 나타났다.
이 실험의 목적은 항냉동제를 사용하지 않고 동시 온도강하 속도를 이용하여 유리화동결 작용 동안 빨대가 서로 다른 위치에 있어도 정액이 생존 할 수 있도록 하는 것이다. 이 절차를 통해 냉동보존의 원리 및 문제가 규명될 것이며 개인 냉동의 가능성 또한 연구될 것이다.
III. 실험 방법
탐구 실험
냉동의 주요 문제점은 세포 안의 자유수에 의한 얼음결정 형성, 큰 부피로 인한 세포 기관의 파괴, 해동 시 대기 중 수분의 승화로 인한 냉동 및 재 결정화 시 급격한 온도 하강으로 인한 세포에의 영향이다.
자세한 설명을 위해 CHA 메디컬 센터의 IVF-ET 클리닉을 방문하여 인간 정액 냉동-해동 과정을 관찰하고 의사들을 인터뷰했다. 그 후 다른 정액을 포함한 여러 종류의 조직 및 세포를 가지고 실험을 했다. 이 실험들을 통해 냉동-해동 과정에서 생겨날 수 있는 문제점을 확인했다. 이 문제점을 하나씩 해결하며 원리를 어느 정도 이해할 수 있었다. 기존 실험을 바탕으로 이 실험에 새로운 항목을 더했다. 돼지 정액의 냉동 문제를 아직 해결하지 못했다는 것을 깨달았다. 오픈풀드스트로우(OPS),전자현미경검사 기술(EM), 냉동루프 같은 다양한 기술이 냉동의 효율성 제고에 사용되는 것을 관찰하며, 본 연구자는 OPS 테크닉을 적용하여 작은 부피의 초소형 빨대를 개발했다. 그 후 이 초소형 빨대를 사용하여 냉동에 민감한 돼지 정액을 냉동하기로 실험을 설계했다. 이 연구를 통해 돼지 정액 냉동 방법에 또 다른 가능성을 제시하고 실험의 깊이를 더함으로써 원리와 세포 및 조직 냉동에 있어 영향을 미치는 주 요인을 파악하고 궁극적으로 개별 냉동 성공에 기여하기를 바라는 바이다.
실험 설계
실험 1. 채집 시기에 따른 가공되지 않은 정액 및 희석된 정액의 정자 운동성
수퇘지 정액을 채집하여 냉장고에 17℃ 온도로 보관한 후 정자 운동성을 측정했다. 희석된 정액의 경우에는 채집 후 3일 내에 인공수정에 사용되어야 하는 것을 발견했다. 본 연구자는 정액 채집 후 보관 기간이 어떻게 정자 운동성에 영향을 미치는 지 연구했다.
실험 2. 빨대 상태에 대한 빨대 부피의 효과 및 냉동 후 정자 운동성
해동 후 정자 운동성의 변화를 살펴보기 위해 1) 0.25mL, 2) 0.5mL, 3) 초소형 빨대 세 가지 다른 부피의 빨대를 사용하여 직접 냉동 및 단계적 냉동 방법이 정자 운동성에 주는 영향을 연구했다.
실험 3. 단계적 냉동에서 예냉기간까지의 정자 운동성의 변화
단계적 냉동에서 해동의 영향을 파악하기 위해, 정액 빨대를 얼음물에 넣고 다른 시간 동안 냉동고에 보관하였다. 그 후 다시 액체 질소에 얼렸다. 마지막으로 해동시킨 후 최적의 예비냉각기간을 알아보기 위해 정액을 살펴보았다.
실험 4. 항냉동제 사용 및 사용하지 않았을 때 냉동 후 정자 운동성의 변화
정자 운동성에 글리세롤의 영향을 파악하기 위해 항냉동제로서 글리세롤을 사용 및 사용하지 않은 베이직 딜루션 미디아(BDM) 및 글리세롤을 사용한 휴먼 프리징 미디어 (HFM)를 사용했다.
실험 5. 다른 온도에 따른 정자 운동성
돼지 정액이 온도에 민감하고 해동에 있어 갑작스러운 온도 변화에 민감하므로 정자 운동성을 위해 여러개의 해동온도를 사용했다.
실험 대상
실험을 위해 한국, 다비지네틱스(Darby Genetics Inc)사에서 가공되지 않은 수퇘지 정액과 희석된 수퇘지 정액을 채집했다..
가공되지 않은 정액(RS)을 세 차례 채집하였고 정액 채집 후 첫째 날 정자 운동성을 실험햇다. 첫번째, 두번째에서는 정자운동성이 100%였고 세번째에서는 92%였다. 희석된 정액(DS) 역시 네 번 채집했다. (표1)정자 운동성은 첫 세 개 샘플의 경우 96%였고 네번 째 샘플의 정자 운동성은 100%였다.(표1)
실험 절차
정자 운동성, 활력, DNA 손상
돼지 정액은17℃에 보관된다. 이 온도에서 돼지 정액의 정자 움직임은 중단되고 운동성을 잃는다. 온도를 체온으로 높인 뒤에 정자 운동성을 측정한다.
정자 운동성이 살아나지 않는다. 따라서 얼린 정액 및 녹인 정액의 정자 운동성 저하가 단순히 정자 운동성 상실 때문인지 정자의 죽음 때문이지 확인하는 것이 매우 중요하다. 에오신 니그로신 염색 기술을 사용하여 정자의 운동성을 관찰한다. 이 염색은 살아있는 세포의 막을 뚫지 못한다. 그 결과 살아있는 정자의 머리가 밝게 표시되는 반면 죽은 정자의 머리는 얼룩져서 어둡게 표시된다. 정자의 낮은 생존력이 정핵 내 DNA 손상과 관련이 있는지 살펴보기 위해 아크라딘오렌지(AO)염색 기술을 사용한다. DNA 손상이 저 수태 및 정자의 기형을 야기할 수 있으므로 이는 아주 중요한 고려요소이다.
소 동결정액(왼쪽)과 인간정액(오른쪽, CHA 출처)
항냉동제가 돼지정액의 정자운동성에 미치는 영향
돼지 정액 동결을 위해 HFM(15%글리세롤 사용)과 BDM(15% 글리세롤 사용 및 미사용)을 주로 사용했다. 글리세롤 같은 투과성의 항냉동제를 포함한 미디어의 응고점은 베이직 미디어보다 낮자. 이는 셀 동결시 손상의 위험을 줄여준다. 그러나 이러한 특성 때문에 항냉동제는 실온(RT)에서 독성을 만들 수도 있다. 따라서 다른 미디어의 항냉동제에 정액을 노출시킴으로써 정자의 운동성 변화를 확인한다.
초소형 빨대 준비 및 시중냉동빨대와의 비교
정액 냉동을 위해 저온 유리병, 0.5ml 빨대, 0.25ml빨대 등이 필요하다. 컨테이너 부피가 클 경우 안에서 컨테이너의 테까지의 거리로 인해 온도하강의 속도가 변한다. 이로 인해 각각의 위치에서 차가운 충격에 노출된 정자 운동성의 시간차가 생긴다. 작은 부피의 초소형 빨대는 0.25ml빨대에 열처리를 가해 다시 크기가 조정될 수 있다. 따라서 일정한 속도로 온도가 하강하는 초소형 빨대의 경우 동결 시 일반적인 컨테이너보다 정자 운동성이 더 활발할 것이다.
직접 냉동 및 단계적 냉동
직접 냉동 방법으로 온도가 -196℃까지 떨어지고 그 결과 .냉동 충격이 발생한다. 그러나 단계적으로 냉동할 경우 정액이 예비냉각을 통해 온도 변화에 적응하여 정자 운동성이 더 높아진다.
IV. 탐구 결과
실험 1. RS 및 DS의 다른 채집시기에 따른 정자 운동성
일반적으로 DS는 첫 정액 채집 후 3일 이내에 사용해야 한다. 이 실험결과는 다른 시간 동안 17℃온도의 냉장고에서 정액을 보관하였을 때 정자 운동성을 보여준다. (표2) RS의 운동성은 이튿날 85%로 줄어들었다. 그러나 DS의 운동성 이튿날에도 여전히 높았으며 사흗날 약간 떨어졌다.(표2) |
유리화동결 논문번역(영어 번역본)I. INTRODUCTION
Swine is an economic animal and is widely used for biotechnological study. It is required to develop an efficient cryogenic preservation technique for swine. This study intends to analyze the unique properties of boar sperm using the semen supplied in liquid form and to discuss the physiological mechanism of boar sperm during the process of freezing and thawing. In particular, it is aimed at developing a micro-straw for minimum volume and therefore, finding the method to increase the viability by simultaneous temperature-fall speed for different straw locations during vitrification. When this method is applied in practical use, it is not necessary to use cryoprotectants producing toxicity at room temperature and this will lead to a simple method with safe use of sperm after thawing.1)
II. THEORETICAL BACKGROUNDS
Recently, the possibility of human freezing technology, which is often introduced in science fictions, significantly increases through researches. Since 1970s, embryo freezing technology has advanced to the stage of successful freezing and thawing in some mammals. Freezing of cells and tissues has been successful in laboratory animals, economic animals and humans in stem cells, cord blood, erythrocytes, sperm, oocytes, embryos, somatic cells such as liver tissues, ovarian tissues, testicular tissues and adipose tissues. While studying principles of the cryopreservation of cells, porcine and bovine sperm were used in pre-experiments and at the same time the characteristics of human sperm were investigated.2)
During this process, it was found that the freezing method of porcine sperm was yet to be developed further while the methods for human and bovine sperm were well established. Successful fertility using frozen boar semen was first reported in the 1970s (Polge et al.) and Huang et al. reported motility by 46 ~ 56%3) in 2009. Porcine is similar to human in anatomy and physiology. Therefore, studies on porcine are actively carried out recently for the purpose of artificial organ productions in human and distribution of frozen boar semen has become highly necessary.4)
Since the boar semen is sensitive to low temperature, it is suggested to be produced in liquid form, stored in refrigerator at 17℃ and consumed within 2 ~ 3 days. Due to such limitations, porcine semen is not only low in economic value, but also is considered low in academic contribution to the breed preservation and improvement or development of porcine transformation. I have reported in the previous study that the frozen bovine sperm, although outstanding in motility and viability, showed high percentage of DNA damage. While the direct-frozen porcine sperm displaying the low motility of 8%, DNA damage was not found.2) Also, the results showed that porcine sperm was sensitive to temperature and concentration of cryoprotectants.
The objective of this study is to find the method of high viability without using cryoprotectants by simultaneous temperature-fall speed for different straw locations during vitrification. Through this process, the principles and problems of cryopreservation will be identified and the possibility for individual freezing will also be studied.
III. RESEARCH METHODS
Exploratory Research
The major problem of freezing was the ice crystal formation by free water inside cell, destruction of cell organelles due to increased volume, impact to cell by rapid temperature fall at freezing and re-crystallization due to sublimation of moisture in air at thawing. For detailed explanation, I visited the IVF-ET Clinic of CHA Medical Center, observed the process of human sperm freezing – thawing and interviewed with the doctors. Then, I conducted experiments using several types of tissues and cells including different sperm. Through these experiments, I identified a number of problems possible to occur during the process of freezing-thawing. By overcoming the problems one by one, I was able to understand the principles to some extent. Based on previous experiments, I added new items in this study, I realized that porcine sperm freezing was a problem yet to be overcome. Observing the various techniques, such as open pulled straw (OPS), electron microscopy (EM) grid, cryoloop and cryotop, were used as freezing tools to increase the efficient of freezing3), I produced a micro-straw of further reduced volume by applying the OPS technique. Then, I designed a technique to use this micro-straw for freezing of porcine sperm sensitive to freezing. Through this study, I hope to propose another possibility of porcine sperm freezing method and to understand the principles and some major influential factors in cell and tissue freezing by increasing the depth of research and therefore to ultimately contribute to success of individual freezing.
Research Design
Experiment 1. Motility by different collection period of raw and diluted semen
After collection of boar semen and their storage in the refrigerator at 17℃, the sperm motility were studied for their motility. It was found that diluted semen should be used for artificial insemination within 3 days after collection. I studied how the storage period after semen collection could affect the motility of sperm.
Experiment 2. Effect of straw volume on straw status and sperm motility after freezing
To see the change of sperm motility after thawing, direct freezing and stepwise freezing methods were examined for their effects on sperm motility using 3 different volumes of straws, 1) 0.25mL, 2) 0.5mL, and 3) micro-straw.
Experiment 3. Change of sperm motility by pre-cooling time in stepwise freezing
To see the effect of pre-cooling in stepwise freezing, semen straw was put in the ice water and stored in the freezer for different time period and then, they were again frozen in the liquid nitrogen. Finally, they were thawed and the sperm motility was examined to find the optimum pre-cooling time.
Experiment 4. Change of sperm motility after freezing with and without use of cryoprotectant
To see the effect of glycerol on sperm motility, Basic dilution media (BDM) with and without glycerol as cryoprotectant and Human freezing media (HFM), which has glycerol in it, were used.
Experiment 5. Sperm motility by different thawing temperature
Since porcine sperm is sensitive to temperature and is significantly influenced by abrupt temperature change for thawing, different thawing temperature was used for sperm motility.
Subjects
For the experiment, boar semen was supplied from Darby Genetics Inc. Korea in both raw and diluted forms.
Raw semen (RS) was supplied three times and was tested for their motility in the 1st day after sperm collection. The motility was 100% for the first and second and 92% for the third time. Diluted semen (DS) also were supplied four times. (Figure 1) The sperm motility was 96 % for the three samples and motility of the fourth was 100%. (Figure 1)
Research Procedures
Sperm motility, vitality and DNA damage
Porcine semen is stored at the temperature of 17℃. At this temperature, porcine sperm falls into the state of suspended animation and therefore loses motility. After increasing temperature to the body temperature, sperm motility is calculated.6)
Sperm motility does not represent viability. Therefore, it is very important to check whether the lowered motility of frozen and thawed sperm is simply the loss of motility or death. Sperm viability is observed using the technique of dying with Eosin-Nigrosin (E-N) stain. This stain cannot penetrate the membrane of live cells. As a result, while the head of a surviving sperm is bright, the head of the dead sperm is stained and therefore, dark. To find out whether the lowered viability of sperm is related to DNA damage inside sperm nucleus, Acridine Orange (AO) stain technique7) is used. Since the use of sperm with DNA damage may cause lowered fertility and deformation, this is an important factor to be considered.
Frozen bovine sperm (left) and Human sperm (right, from CHA)
Impact of cryoprotectants on motility of porcine sperm
For freezing of porcine sperm, HFM (with 15% glycerol) and BDM (with or without 15% glycerol) were mainly used. The freezing point of media including permeable cryoprotectants such as glycerol is lower than that of basic media. This lowers the risk of damage while cell freezes. However, due to this characteristic, cryoprotectants might produce toxicity at room temperature (RT). Therefore, changes in the motility of sperm will be checked by exposing sperm to cryoprotectants of different media.
Micro-straw preparation and comparison with commercial freezing straws
For sperm freezing, cryovial, 0.5ml straw and 0.25ml straw, etc. are used. When the container volume is large, speed of temperature fall changes due to the distance from inside to the rim of container. This causes difference in the time of sperm viability at each location exposed to cold shock. Micro-straw with reduced volume can be resized by applying heat treatment to the 0.25ml straw. Therefore, micro-straw with consistent speed of temperature fall will produce higher motility than general containers when applied to freezing.
Direct freezing and stepwise freezing
Direct freezing method sharply drops the temperature down to -196℃, which results in freezing shock. However, stepwise freezing leads sperm to get adapted to the change of temperature through pre-cooling, which will yield a higher sperm motility.
IV. RESULTS
Experiment 1. Motility by different collection period of RS and DS
In general, DS is recommended to use within 3 days after the first sperm collection. The result in this study showed the sperm motility when stored in the refrigerator at 17℃ for different storage time period. (Figure 2) The motility of RS lowered to 85% in day 2. However, DS was still higher in motility even in day 2 and slightly dropped in day 3. (Figure 2) |
