유전자 발현 바이오마커 번역(한국어 원본)4종류의 서로 다른 농도로 loading 되어진 test system에서의 freely dissolved concentration은 앞에서 실시하였던 실험(Figure1)과 마찬가지로 실험 종료시까지 안정적으로 intended concentration을 유지하고 있는 것으로 나타났다(Figure 3). For gene expression results, C. elegans의 cyp35a family 유전자들 중 cyp35a1은 농도 변화에 큰 반응이 나타나지 않았고, cyp35a4와 cyp35a5는 각 농도별로 시간에 따라 일정하게 증가하는 경향은 보였으되, 2 times이하의 증가 값을 보여주었다(supporting data). 반면 cyp35a2와 3는 매우 민감하게 gene expression이 노출 초기부터 꾸준히 증가하는 경향을 보였다(figure 4). The closest humand counterparts of the CYP-35A family, the highly diverse families CYP-1 and CYP-2, metabolize both exogenous and endogenous compounds. 그러나, 그중에서도 cyp35a1은 계통분류학적으로 다른 4종류의 유전자와 가장 다르며, cyp35a2와 cyp35a3가 매우 유사하다(Aarnio et al., 2011). 같은 genetic function을 가지고 있더라 하더래도 독성 물질에 대한 반응은 서로 다르게 나타날 수 있으며, 본 연구에서는 CP에 민감하게 반응하는 cyp35a2와 cyp35a3를 마커로 사용하여 농도에 따른 시간의 정량화를 실시하였다.
Supporting data에서 표기하여 알 수 있듯이, cyp35a2와 cyp35a3 유전자는 노출 시간이 길어짐에 따라, 그리고, CP의 농도가 높아짐에 따라 선형적으로 증가하는 경향을 확인할 수 있다. 그러나, CP의 0.03mg/L의 노출 농도에서는 그 영향이 거의 나타나지 않았다.
결과적으로, 노출 농도와 노출 시간에 따른 유전자 발현 영향값을 통해 우리는 Low observed effect concentration(LOEC) 값을 0.06mg/L이며, No observed effect concentration(NOEC)값이 0.03mg/L임을 제안 할 수 있다. Table 1은 기존에 보고되어진Chlorpyrifos에 대해 다양한 종말점을 이용한 독성 값들과 본 연구에서 얻은 독성 값을 비교한 것이다. C. elegans를 이용한 CP의 독성 값은 3-0.001mg/L까지 였다. Biological organization의 higher level인 parameter들, 예를 들어 mortality, growth, movement and reproduction,을 이용한 연구 결과에서 독성값이 상위에 link된 것을 알 수 있다. 특히, Ruan et al.,2009에서는 Movement를 독성 종말점으로 이용하여 연구한 결과로 24h-LOEL값이 3mg/L인것으로 제안하였다. 이 실험에서 solvent는 사용하지 않았고, K-media에 직접 녹여서 사용하였는데, Chlorpyrifos의 23도씨의 water solubility가 2mgL인 것을 감안할 때 환경 위해성 평가를 위한 독성값을 산출할때에는 고려할 수 없는 data가 된다. Gene expression이나enzyme activity를 종말점으로 적용한 경우는 0.1mg/L이하의 독성값들이 제시되었다. 본 연구에서 제시한 LOEC과 NOEC값은 지금까지 보고되어진 다른 독성값들보다도 낮은 수준에서 제시되었으며, 8시간의 단기간에 그 반응을 조사할 수 있다는 특화된 장점이 Table 1을 통해 확인되었다. 비록, Roh and Choi, 2008에서 제시한 development 독성 종말점을 이용하여 얻은 농도가 낮은 수준일지라도 96시간이라는 장기 노출이라는 점, multigeneration을 통해 얻어진 독성 값이라는 것을 고려한다면, 본 연구에서 제시한 독성값이 solvent를 사용하지 않고 초기에 민감하게 독성반응을 quantification하여 얻은 promising 한 결과라는 점에서는 조금도 부족함이 없다.
환경 위해성 평가를 위해 biomarker라는 민감하고 특화된 종말점을 활용하기위해서는 먼저 노출 환경에 대한 정의가 확실해야하며, 이를 정량화 할 수 있어야한다. 지금까지는 생체내 복잡한 반응을 하나의 지표로 용량반응관계를 설명하기 어렵다는 점과 노출농도에 대한 표기가 어떻게 이루어져야 독성 반응과의 관계를 믿을만하게 이해할 수 있는냐라는 문제에 봉착했있었다.그러나, 본 연구 결과들을 통해 기존의 노출 방법보다 promising한 passive dosing을 실험실 수준의 biomarker연구에 적용해 용량반응관계를 설명할 수 있을것이라는 단서와 이를 통해 실제로 얻어진 독성값이 기존의 organism 수준의 독성값들보다 훨씬 민감하며 조기에 검출할 수 있음을 확인하였다. 이를 통해 앞으로 좀 더 정량화되어진 biomarker연구들이 활발하게 environmental risk assessment 를 위해 제공되어질 것으로 기대한다. |
유전자 발현 바이오마커 번역(영어 번역본)In the test systems loaded with four different types of concentrations, the freely dissolved concentration was stable at target level until the end of the experiment (Figure 3), as in the previous experiment (Figure 1). Of cyp35a family genes of C. elegans, cyp35a1 did not show significant response to concentration changes, while cyp35a4 and cyp35a5 expression constantly increased over time at a moderate level (below 200% of the original level) for each concentration (Supporting Data). In contrast, gene expression for cyp35a2 and cyp35a3 very sensitively increased from the onset of exposure (Figure 4). The highly diverse families CYP-1 and CYP-2, which are the closest human counterparts of the CYP-35A family, metabolize both exogenous and endogenous compounds. Even among these, cyp35a1 is taxonomically most distinct from the other four types of genes while cyp35a2 and cyp35a3 are very similar (Aarnio et al., 2011). Even if two genes have the same genetic function, their responses to toxic compounds may be different. In this study, we used cyp35a2 and cyp35a3 as markers due to their sensitivity to CP, and quantified responses at different concentrations over time.
As shown in the Supporting Data, expression of cyp35a2 and cyp35a3 genes linearly increased with exposure time and CP concentration. However, these effects were minimal at CP exposure concentration of 0.03 mg/L.
From observing gene expression levels at different exposure concentrations and durations, we propose that low observed effect concentration (LOEC) is 0.06 mg/L and no observed effect concentration (NOEC) is 0.03 mg/L. Table 1 compares the literature toxicological values for chlorpyrifos obtained through various end points and the values from this study. Toxicological values for CP using C. elegans were up to 3-0.001 mg/L . Studies using higher-level parameters of biological organization such as mortality, growth, movement, and reproduction show that the toxicological values are linked to the higher level. Especially, Ruan et al (2009) used movement as the toxicological end point and proposed that 24h-LOEL is 3 mg/L. In this experiment, they directly dissolved the reagent in K-media instead of using solvent. However, considering that water solubility of chlorpyrifos at 23 ºC is only 2 mg/L, results from their study cannot be used to calculate toxicological value for environmental risk evaluation. Studies using gene expression or enzyme activity as end point suggested toxicological values below 0.1 mg/L. LOEC and NOEC proposed in this study are lower than the toxicological values reported to date. In addition, our method can be used to survey response quickly, after 8 hours (Table 1). Although the concentration reported by Roh and Choi (2008) using development as the toxicological end point is lower, their method requires long-term exposure over 96 hours and the toxicological value is obtained over multi-generation. In comparison, the toxicological values from this study are promising in that they were obtained without using solvent and by quantifying toxicological response quickly and sensitively.
To utilize the sensitive and specialized biomarkers as an end point for environmental risk evaluation, it is first necessary to clearly define the exposure environment and be able to quantify it. Until recently, main challenges involved the difficulty in explaining the dose-response relationship using complex biological responses within the body as a single index, and the question of how to represent the exposure concentration in order to reliably understand the relationship with toxicological response . Using the results from this study, we demonstrated the possibility of using passive dosing on a laboratory-scale biomarker research to describe the dose-response relationship, and that the toxicological values obtained using this method are much more sensitive than those previously obtained on organism-level studies as well as allowing early detection of the toxin. It is hoped that results of this study may be used towards more quantifiable and active biomarker research for environmental risk assessment. |
