유전자 발현 연구 번역

유전자 발현 연구 번역(한국어 원본)

Gene level을 포함하는 biomarker를 환경 생태 독성 평가 및 모니터링을 위한 tool로서 적용하기 위한 노력과 관심은 지난 몇 년간 지속적으로 이어지고 있다. 초기 biomarker 연구의 관심이 enzyme activity를 기반으로 하는 biochemistry였다면, 최근에는 protein생성 단계의 많은 정보를 포함하고 있는 transcriptome 분석을 기반으로 하는 genetics로 확대되고 있다. 다양한 매체내 생태 종들의 유전정보들이 오랜 기간을 거치며 축적되어 제공되고, real-time PCR, microarray, gene sequencing등 gene 분석을 위한 다양한 기술들이 보급화되면서, gene expression은 환경 위해를 평가하기 위한 민감하고, 특별한 생태 독성학적 종말 점으로 부각되었다. 많은 연구자들이 토양, 담수, 해수, 침전물 등 모든 환경 매체 내에서 매우 다양한 생물 종을 이용하여 gene expression의 독성 반응을 통한 환경 평가 및 모니터링을 시도하고 있다.
그러나, Gene expression은 exogenous 또는 endogenous의 stress에 대한 생체내 초기 반응이라는 점이 environmental health를 종합적으로 평가함에 있어서는 negative한 면이 될 수도 있는 양면성을 가지고 있다. 세포내 수준의 반응으로 개체 및 개체군에서 발생할 수 있는 독성 반응을 직접적으로 설명하기가 매우 어렵기 때문이다. Forbes et al., 2006은 gene expression이 whole organism에서 발생하는 physiological response는 물론이며, population, community와 같은 환경생태를 평가하는 데에는 적합하지 않다고 보고하고 있다. 또한 gene expression이 생체 내에서 매우 복잡한 network를 형성하고 있기 때문에 time-, concentration의 용량 반응관계가 명확하게 성립되기 어렵다고 평가한다. Gene expression이 민감하고 좋은 endpoint임에도 불구하고 노출 환경(i.e. exposure concentration and duration)과 adverse outcome(survival, behavior, reproduction, etc.)과의 인과관계가 명확하게 설명되지 못한다면 이는 독성 영향의 한 단면만을 보여주는 것에 그칠 수도 있다. 우리는 본 연구에서 좀 더 clear하게 노출 조건을 설명할 수 있는 방법을 적용하고 이를 통해 gene expression의 효용 가치를 높일 수 있는 방향을 제시하고자 한다.
실제로 C. elegans의 genetic information을 이용하여 독성반응연구를 시행한 결과들이 매우 많으며, 또한, 이를 실제 field에 적용한 사례들도 있다. 우리는 C. elegans를 target 물질로 선정한 Chlorpyrifos에 노출 시켜 본 연구를 수행하였다. CP는 cyp에 의해 oxidization되는 물질로, C. elegans는 human의 cytochrome p450와 유사한 xenobiotic metabolism을 담당하는 cyp35a family gene 들이 있다(cyp35a1-5). 이 gene 들을 quantitative real-time PCR로 조사하였다.

CP의 표준상태 (20 °C)에서 수용해도와 증기압의 범위는 각각 0.4 – 2 gm-3과 0.0022 – 0.0067 Pa 측정/보고되었다. CP는 물에 대한 높은 친화력을 가지는 반면에 증기압은 낮으므로 본 연구의 노출 환경에서 CP는 대기를 통한 증발로 손실되는 양은 거의 없거나 무시할 수 있는 수준이다. 즉, Figure 1A에서 나타난media 내의 CP의 손실은 내부에서 야기될 수 있는 plate 및 생물 흡착에 의해 발생된 것임을 알 수 있다. 특히, 1ml의 media volume을 이용하여 실험을 실시한 경우, C. elegans가 투입되었을 때의 CP의 농도와 투입되지 않았을 때의 농도 차는 외부로의 손실이 없다는 전제하에 생물농축에 의한 차이로 설명할 수 있으며, 이를 이용하여 bioconcentration factor를 추정할 수 있다. Passive dosing method의 경우, polystyrene plate 벽면에 PDMS가 닿도록 장착하고 내부에 media를 넣는 형태로 노출 환경을 구성하게 된다. 실제적으로, PDMS는 polystyrene과 liquid media라는 두 종류의 medium phase를 접하게 되지만, polystyrene의 확산은 매우 낮을 것으로 추정되므로, PDMS로부터 CP가 plate 내부로 흡수되어 손실될 양은 무시할 수 있다. 따라서, PDMS는 온전히 k-media와만 평형상태를 이루게 되고 Figure 1B와 같이 일정한 농도를 유지할 수 있게 된다.
Spiking method로 실시한 실험에서는 같은 nominal concentration으로 노출되었음에도 불구하고, 총 노출media volume에 따라 유전자 발현 정도가 매우 다르게 나타난 반면, passive dosing으로 constant exposure concentration이 제공되어진 경우에는 노출 plate(6well or 24 well)의 조건과 관계없이 gene expression이 비슷한 수준으로 나타났다. Cyp35a4,5 유전자의 expression은 실험이 시작한 뒤 8시간만에 대조군 대비 1.5배 정도의 증가 peak를 나타내고, 이후 다시 무반응의 수준으로 감소하였다. Passive dosing으로 CP를 C. elegans에 노출 시킨 경우에는 gene expression이 cyp35a1을 제외하고 시간에 따라 선형적인 증가추세를 보였다. 특히, cyp35a2와 cyp35a3 gene은 실험 시작 8시간만에 대조군 대비 약 5배 가량 gene expression이 증가하는 경향을 보였다.
CP는 octanol:water 분배계수가(log P) 4.7로 초기 uptake및 bioaccumulation의 가능성을 나타내는 물질이지만(REF), 체내에서 cytochrome P450에 의한 빠른 대사로 elimination half-life가 짧아 빠르게 정화되는 물질이다. 즉, CP는 생물 체내에서 CP형태로 잔류하며 장기간 축적될 가능성은 낮은 물질이므로, 외부에서 제공되어지는 물질의 생물학적 이용 가능한 농도가 대사의 활성을 좌우하게 된다. C. elegans 주변 환경에서 실제 생물학적으로 이용 가능한 CP의 자유농도가 감소하자, target물질의 대사 작용이 종료되어 더 이상 cytrochrome P450의 mRNA 역할이 필요 없게 되었다는 시나리오가 이를 설명할 수 있을 것이다. Figure 1A는 제한된 노출 환경에서 생물 종의 독성 반응을 자유농도를 가지고 설명하는 것이 nominal concentration을 이용하는 것보다 믿을만하다는 주장과 일치하는 결과라고 제안할 수 있다. 자유농도가 상대적으로 덜 손실된 10ml media volume을 이용한 실험결과에서 gene expression 패턴이 1ml media volume을 이용한 gene expression보다 증가하는 경향을 나타낸 것도 앞의 주장을 뒷받침하는 결과라고 말할 수 있다.

CP는 cytochrome P450 대사에 의해 신경 독성 대사 산물인, chlorpyrifos-oxon (CPO)으로 bioactivated된다(REF). CPO는 acetylcholinesterase activity를 inhibition시킴으로서 neural junction에서the neurotransmitter acetylcholine 의 accumulation을 초래한다. 이러한 콜린성 독성은 신체 기능 손실, 행동이상등이 있으며, 누적으로 인한 죽음까지도 포함된다(환경종 연구결과 ref). 본 연구에서는 CP의 대사 산물의 생성 정도나, 이로 인한 acetylcholinesterase activity의 이상과 관련한 조사는 실시하지 못하였다. 그러나, C. elegans의 행동학적 이상증상이나, 24시간 이내의 mortality가 나타난 것은 passive dosing에 의해 CP의 자유농도가 지속적으로 제공되어짐으로 인한 생체내 독성 누적의 결과로는 설명할 수는 있다.

유전자 발현 연구 번역(영어 번역본)

For the last several years, a lot of attention has been paid to biomarkers including genetic level studies and efforts have been made to use them as a tool for ecotoxicological evaluation. The focus of early biomarker studies was on biochemistry based on enzyme activity, whereas, in recent years, the focus has been shifted to genetics based on the transcriptome analysis, which includes a lot of information on the protein production stage. As the genetic information of ecological species in various media accumulated over long period of time has been available and various technologies for gene analysis, such as real-time PCR, microarray, and gene sequencing have been used widely, gene expression has emerged as a sensitive and specific ecotoxicological end point to evaluate environmental risks. Many researchers have attempted environment evaluation and monitoring through toxicological response of gene expression using diverse species in environmental media including soil, fresh water, salt water, and sediment.
However, gene expression cuts both ways as it is an early response in the body to exogenous or endogenous stress, which could be a negative factor in the overall evaluation of environmental health. Because explaining the toxicological response that could occur in the individual or population with intracellular level response is very difficult. Forbes et al., reported in 2006 that gene expression is not suitable for the evaluation of environmental condition, such as population and community as well as the evaluation of physiological response occurring in the whole organism. Moreover, they assessed that as gene expression forms a very complicated network in the body, it is difficult to establish the relationship between time and concentration and dose response clearly. Even though gene expression is a sensitive and good endpoint, if causal relationship between exposure environment(i.e. exposure concentration and duration) and adverse outcome(survival, behavior, reproduction, etc.) cannot be explained clearly, it could show just one aspect of toxicological effects. In this study, we used a method that can explain the exposure conditions more clearly, and presented a way to enhance the utility of gene expression through this.
Toxicological response studies using the genetic information of C. elegans have produced a lot of results and these results have been applied to the field actually. We carried out a study in which C. elegans was exposed to Chlorpyrifos(CP), the target chemical. CP is a chemical that is oxidized by cyp and C. elegans has cyp35a family genes(cyp35a1-5), which are similar to human cytochrome p450, that are involved in xenobiotic metabolism. We investigated these genes using quantitative real-time PCR.
The ranges of water solubility and vapor pressure at normal condition of CP (20 °C) were measured/reported to be 0.4 – 2 gm-3 and 0.0022 – 0.0067 Pa respectively. CP has a strong affinity for water but low vapor pressure capacity, so in the exposure environment of this study, the level of CP loss through evaporation is close to nil or negligible. In other words, the loss of CP in the media in Figure 1A is due to internal adsorption by the plate and organisms. Especially, when the experiment was carried out using media volume of 1 ml, the difference in the CP concentration when C. elegans were added and that when C elegans were not added can be explained as a difference caused by biological concentration, provided that there is no external loss. And bioconcentration factor can be estimated using this. For the passive dosing method, exposure environment was structured so that PDMS was placed to touch the polystyrene plate wall and insert media inside. In actuality, PDMS comes into contact with two types of medium phases, polystyrene and liquid media, and the amount of CP absorbed into the plate from PDMS and gets lost is negligible since the diffusion of polystyrene is estimated to be very low. Therefore, PDMS is in equilibrium with k-media only and maintains a constant concentration as in Figure 1B.
In the experiment using spiking method, the level of gene expression differed greatly according to the total exposure media volume even though organisms were exposed to the same nominal concentration. On the other hand, when constant exposure concentration was provided through passive dosing, gene expression was similar regardless of the condition of exposure plate(6 well or 24 well). The expression of Cyp35a4,5 genes increased 1.5 times that of the control and reached peak 8 hours after the onset of experiment, then decreased to no response level afterward. When C. elegans were exposed to CP using passive dosing, gene expression showed linear increase over time except cyp35a1. Especially, expression of cyp35a2 and 3 genes increased to five times that of the control after 8 hours of exposure.
CP is a chemical(REF) that shows initial uptake and bioaccumulation possibility since its octanol:water distribution coefficient(log P) is 4.7, but it is quickly neutralized as its elimination half life is short due to fast metabolism by cytochrome P450 in the body. In other words, as CP is a chemical that has a low possibility to be accumulated in the body in the form of CP, biologically usable concentration of the substance provided by external sources decides the metabolic activity. The scenario in which when the freely dissolved concentration of biologically usable CP in the C elegans environment decreased actually, the metabolism of target chemical stopped and mRNA role of cytrochrome P450 was not needed anymore can explain this. It can be said that Figure 1A shows the results that coincide with a claim that explaining toxicological response of biological species in the limited exposure environment is more reliable than explaining it using nominal concentration. The fact that the gene expression pattern showed more increasing trend in the experiment using 10ml media volume with relatively lower loss of freely dissolved concentration than in the experiment using 1ml media volume also supports above claim.

CP is bioactivated(REF) into chlorpyrifos-oxen(CPO), a neurotoxic metabolite, by the metabolic activity of cytochrome P450. CPO causes accumulation of neurotransmitter acetylcholine in the neural junction by inhibiting acetylcholinesterase activity. Such cholinergic toxicity could cause loss of bodily function and abnormal behavior, and its accumulation could result in death(환경종 research result ref). This study did not investigate the level of CP metabolite formation and abnormality in acetylcholinesterase activity due to this. However, abnormal behavior and mortality within 24 hours in C elegans can be explained by the accumulation of toxicity in the body through continuous supply of freely dissolved concentration of CP due to passive dosing.