전기영동법 웨스턴블랏법 번역(한국어 원본)3) 전기영동법 에스디에스-폴리아크릴 아마이드 겔 전기영동법에 따라 시험하여 검액과 표준품의 주밴드를 확인한다. 전기영동 겔은 12%의 NuPAGEⓇ Novex Bis-Tris Gel (Invitrogen사)을 사용한다. 검액에 대한 양성 대조군으로서 대웅 표준품을 사용한다. 검액 및 대웅 표준품에 4X NuPAGEⓇ LDS 샘플 완충용액 (Invitrogen사)와 10X NuPAGEⓇ Reducing Agent (Invitrogen사)를 가한 다음 70℃에서 10분간 열처리한다. 시료를 겔에 주입한 후 NuPAGEⓇ MES Running Buffer (Invitrogen사, Cat. No. NP0002)를 채운 전기영동장치 (Invitrogen사, Xcell SureLockTM Mini-Cell)를 이용하여 시료에 첨가한 샘플 완충용액의 밴드가 겔의 끝에서 1～2 cm에 도달할 때까지 200 V의 일정한 전압으로 전기영동을 실시한다. 전개가 끝나면 쿠마시 염색 방법으로 겔을 염색한다. 그 후 검액과 EGF 표준품의 전개위치를 비교하여 동질성을 판단한다. 4) 웨스턴블랏법 웨스턴블랏법에 따라 시험할 때 검액과 표준품의 주밴드의 위치가 동등하여야 한다. 확인시험의 전기영동법에 따라 전기영동을 수행한다 (단, 쿠마시 염색을 수행하지 않는다). 4장의 스폰지 패드와 2장의 여과지를 전사 용액 (25 mM Bicine, 25 mM Bis-Tris (free base), 1 mM EDTA, methanol)에 충분히 적신다. PVDF 멤브레인은 메탄올에 30초간 적신 후 증류수와 전사 용액에 순서대로 충분히 적셔 준다. 2장의 스폰지 패드 위에 1장의 여과지를 놓고, 전기영동을 완료한 겔을 올려 놓는다. 전사용액에 적신 PVDF 멤브레인을 겔 위에 놓고, 나머지 여과지 1장과 2장의 스폰지 패드를 순서대로 올린 후 30 V 전압으로 1시간 동안 이동시킨다. 전사된 PVDF 멤브레인을 꺼내 500 mM NaCl과 20 mM Tris-HCl (pH 7.5)로 구성된 완충용액 (TBS 용액)으로 세척한 후 5% 탈지분유를 함유한 TBS 용액 (블라킹용액)을 가하여 1시간동안 상온교반시킨다. 0.05% Tween-20을 함유하는 TBS 완충용액 (TBST 용액)으로 세척한 후 알에이치-올리고펩타이드-1에 대한 마우스 단 클론 1차 항체 (R&D Systems, 미국)를 1:1,000의 비율로 블라킹용액에 희석하여 1시간동안 상온교반한다. TBST 용액으로 세척 후 alkaline phosphatase가 붙은 염소 유래 마우스 2차 항체 (Sigma, USA)를 블라킹용액으로 5,000~10,000 배 희석하여 1시간동안 상온교반한다. 2차 항체용액을 제거한 후 TBST 용액으로 세척 후 증류수 20 mL에 229.1 mg의 BCIP/NBT (5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphatate-nitro blue tetrazolium) 2정을 충분히 녹인 발색용액 20 mL을 PVDF 멤브레인에 가하여 5분간 상온교반한다. 증류수로 세척하여 반응을 중지시키고 완전히 말린 후 표준품과 검액의 단백질 밴드를 확인한다. 5) 등전집속법 검액의 주밴드가 표준품의 주밴드와 동등한 위치이여야 한다. 검액 및 표준품을 1.0 mg/mL로 제조한다. 제조한 검액과 표준품을 2X 완충용액 (Invitrogen사)으로 2배 희석하여 준비한다. 등전집속 겔은 pH 3 ~ 7의 ampholyte를 포함하는 pre-cast 겔 (Invitrogen사)을 사용하며 양극에서 음극방향으로 3 ~ 7의 pH gradient가 걸려있는 전기장에서 시료를 전개시킨다. 시료를 웰당 20 μL씩 주입한 후, 양극 완충용액 (Invitrogen사)과 음극 완충용액(Invitrogen사)을 부가한 전기장치 (Invitrogen사, Xcell SureLockTM Mini-Cell)에서 100 V, 200 V의 전압으로 각각 1시간씩, 500 V의 전압으로 30분을 전개시킨다. 겔을 115 g/L 트리플로로아세트산 (TFA)과 34.5 g/L sulphosalicylic acid를 포함하는 고정용액에 30분간 담궈 둔 후, 쿠마시 염색 방법으로 겔을 염색한다. 염색한 겔에서 표준품과 검액의 밴드를 확인한다. 2) 액체크로마토그래프법 주피크 이외 피크 면적의 합이 전체의 5% 이하이어야 한다 (이 때 용매 피크는 제외한다). 검액 및 표준품을 10 mM sodium phosphate (pH 6.5) 완충용액으로 약 0.5 mg/mL의 농도가 되도록 희석하여 준비한다. 분리도 용액 (resolution solution, 알에이치-올리고펩타이드-1의 탈아미드/천연형/분해형 혼합물)은 표준품을 10 mM sodium phosphate (pH 6.5) 완충용액으로 약 0.5 mg/mL으로 희석하여 37 ℃에서 약 1주일간 방치하여 제조한다. 검액, 표준품, 분리도 용액을 10 μL씩 주입하여 아래와 같은 조건에서 액체크로마토그래프법으로 수행한다. 4) 겔여과 고속액체크로마토그래피법 주 피크의 유지시간보다 유지시간이 빠른 모든 피크에 해당하는 면적의 합이 전체의 2% 이하이어야 한다 (이 때 용매 피크는 제외한다). 검액 및 표준품을 100 mM sodium phosphate (pH 7.0) 완충용액으로 약 0.5 mg/mL의 농도가 되도록 희석하여 준비한다. 분리도 용액은 RNase A와 표준품을 1:1 (v/v)로 혼합하여 제조한다. 검액, 표준품, 분리도 용액을 10 μL씩 주입하여 아래와 같은 조건에서 크로마토그래피를 수행한다.
조작조건
칼 럼 : G2000SWXL (7.8 × 300 mm, 5 μm particle size, Tosoh사)
유 속 : 0.75 mL/min
칼럼온도 : 상온
검출파장 : 214 nm
용출조건 :100 mM sodium phosphate 완충용액 (pH 7.0)
* 시험 적합성
크로마토그램에서 RNase A와 표준품이 분리가 되어야 하고 그 분리도는 1.5 이상이어야 한다. 또한, 대웅 표준품 피크의 대칭성은 1.5 이하이어야 한다. 5) 숙주유래 DNA 숙주에 특이적인 primer와 probe를 사용하여 중합효소연쇄반응(PCR)법 등으로 잔류 DNA양을 측정할 때, 산출한 DNA 함량은 1개 조제량(주성분 4㎍)을 기준으로 100 pg 이하이어야 한다. – 기준이 너무 높습니다. 전체 DNA의 양이 10 ppm 이하로 설정.
primer와 probe에 대한 구체적인 sequence EH는 인증번호가 필요합니다. |
전기영동법 웨스턴블랏법 번역(영어 번역본)3) Electrophoresis
Use SDS-polyacrylamide gel electrophoresis to confirm main bands of the standards and the samples. For the experiment, use 12% NuPAGEⓇ Novex Bis-Tris Gel (Invitrogen) and the standard from Daewoong as the positive control. Add 4X NuPAGEⓇ LDS sample buffer (Invitrogen) and 10X NuPAGEⓇ Reducing Agent (Invitrogen) to the samples and standards, and heat at 70 ℃ for 10 minutes. After loading the samples onto the gel, fill the gel electrophoresis chamber (Xcell SureLockTM Mini-Cell, Invitrogen) with NuPAGEⓇ MES Running Buffer (Invitrogen) and run the gel at 200 V until the band of the sample buffer added to the samples is at 1~2 cm from the end of the gel. Next, use Coomassie Blue stain to stain the gel. Finally, compare the position of the bands of the samples with those of the EGF standards to determine equivalence. 4) Western blot
When performing the western blot, the main bands of the sample and the standard must be located at the same height. Perform gel electrophoresis as in the confirmation tes t, but do not stain the gel with Coomassie Blue. Soak four sponge pads and two filter papers with transcription buffer (25 mM Bicine, 25 mM Bis-Tris (free base), 1 mM EDTA, and methanol). Soak PVDF membrane in methanol for 30 seconds, then soak sufficiently in distilled water and then in transcription buffer. Put a sheet of filter paper on two sponge pads, and place the completed gel on the top. Place the PVDF membrane soaked with transcription buffer on top of the gel, cover with the remaining sheet of filter paper, and then with two sponge pads. Next, move the bands at 30 V for one hour. Once finished, remove the PVDF membrane and wash with TBS (Tris-buffered saline (pH 7.5), 500 mM NaCl and 20 mM Tris-HCl), and then add TBS with 5% nonfat dry milk (blocking solution) and stir at room temperature for one hour. Wash with TBS with 0.05% Tween-20 (TBST solution), and then dilute mouse monocolonal primary antibody for rh-oligopeptide-1 with the blocking solution at 1:1,000 ratio, and stir at room temperature for one hour. Wash again with TBST solution, and then dilute alkaline phosphatase conjugated goat anti-mouse secondary antibody (Sigma, USA) with blocking solution by 5,000~10,000X, and stir at room temperature for one hour. Remove the secondary antibody solution, wash with TBST solution, and add 20 mL of substrate solution (two tablets of 229.1 mg BCIP/NBT (5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphatate-nitro blue tetrazolium) dissolved in 20 mL of distilled water) to the PVDF membrane and stir at room temperature for 5 minutes. Wash with distilled water to terminate the reaction, dry the membrane, and confirm the protein bands of the standards and the samples. 5) Isoelectric focusing
The main bands of the sample and the standard must be located at the same height.
Prepare the samples and standards at 1.0 mg/mL concentration. Dilute the samples and the standards to half their concentration using 2X buffer (Invitrogen). Use pre-cast gel with pH 3~7 ampholyte (Invitrogen) for the experiment. Run the gel in an electric field with pH gradient of 3~7 in the direction from the cathode to the anode. Load 20 μL of the samples for each well, insert the gel in the cell (Xcell SureLockTM Mini-Cell, Invitrogen), add buffers for the cathode and the anode (both from Invitrogen), and run the gel at 100 V for one hour, 200 V for one hour, and 500 V for 30 minutes. Soak the gel in the fixing solution with 115 g/L trifluoroacetic acid (TFA) and 34.5 g/L sulphosalicylic acid for 30 minutes, and stain the gel with Coomassie Blue stain. Confirm the bands of the standards and the samples from the stained gel. 2) Liquid chromatography
Sum of the peaks other than the main peak must be below 5% of the total area (excluding the solvent peak). Prepare the samples and the standards at 0.5 mg/mL concentration using 10 mM sodium phosphate (pH 6.5) buffer. Prepare the resolution solution (mixture of deamidated, natural, and degraded rh-oligopeptide-1) by diluting the standards with 10 mM sodium phosphate (pH 6.5) to a concentration of 0.5 mg/mL and incubating at 37 ℃ for a week. Add 10 μL each for the samples, standards, and the resolution solution, and perform liquid chromatography as described below. 4) Gel filtration high-performance liquid chromatography
Sum of areas for all peaks with retention time faster than the main peak must be below 2% of the total area (excluding the solvent peak). Prepare the samples and the standards at 0.5 mg/mL concentration using 100 mM sodium phosphate (pH 6.5) buffer. Prepare the resolution solution by mixing RNase A and the standard at 1:1 volume ratio. Add 10 μL each for the samples, standards, and the resolution solution, and perform liquid chromatography as described below.
Operating condition
Column: G2000SWXL (7.8 × 300 mm, 5 μm particle size, Tosoh)
Flow rate: 0.75 mL/min
Column temperature: room temperature
Detection wavelength: 214 nm
Elution conditions: 100 mM sodium phosphate buffer (pH 7.0)
* Conformance requirements
RNase A and the standard peaks must be separated in the chromatogram with degree of separation above 1.5. Also, symmetry of the standard peak must be below 1.5. 5) Host cell DNA
When using primer and probe specific to the host to measure the amount of remaining DNA using PCR, the measured DNA must be below 100 pg with respect to single sample (4㎍ of main ingredient). – The standard is too high. Total amount of DNA should be set to below 10 ppm. Detailed sequence EH for the primer and the probe requires certification number. |
