백일해 백신 독성연구 번역

백일해 백신 독성연구 번역(한국어 원본)

오늘 저는 녹십자사와 식품의약품평가원의 국제공동연구 결과와 이를 통한 저의 견해를 발표하도록 하겠습니다. 또한 마지막 두 개의 슬라이드를 통해 제가 수행하였던 결과를 말씀드리면서 몇가지 고려할 사항을 말씀드리도록 하겠습니다.

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먼저 공동연구(BSP114 Phase II)에서 사용하였던 모든 Material과 시험방법은 EDQM에서 제시하는 동일한 방법으로 수행하였음을 먼저 말씀드리도록 하겠습니다.

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다음 슬라이드는 CHO 세포 기반의 시험법결과를 판정하는 대표적인 양상에 대한 사진입니다. 첫 번째 슬라이드는 대표적인 양성반응으로서 세포의 응집반응 (cell clustering) 보이는 사진입니다. 백일해 독소(pertussis toxin)에 의해 세포들이 변형이 일어나는 전형적인 사례로서, 일정 독소의 양에 따라 비례적으로 세포들이 응집이 일어납니다.
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다음 슬라이드는 대표적인 음성반응으로서 백일해 독소가 없을 때 cell clustering이 보이지 않는 사진입니다. 세포실험에 있어서 96 well plate의 단점으로는 well의 크기가 매우 작기 때문에 세포들이 균일하게 well에 부착되기 위해서는 보다 많은 시간의 resuspension time이 필요합니다. 특히 trypsin를 처리시에 세포에서의 toxin receptor의 digestion을 막기위해서는 충분한 시간을 주지 못하기 때문에 더욱더 균일하게 부착되기가 힘든 것도 사실입니다.

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마지막으로 백신의 Aluminum adjuvant의 영향으로 세포가 자라지 못하거나, 그 모양이 정상적이지 못한 형태를 갖추거나, 세포사멸(cell death)가 보이는 유형으로서 대표적인 invalid의 유형이 보여지는 사진입니다. 나중에 말씀드리겠지만 이러한 Aluminum adjuvant의 영향으로 그 모양이 정상적이지 못하기 때문에 때로는 백일해독소에 의한 cell clustering과 유사한 clustering 형태가 때때로 보여 결과를 판정하는데 모호하거나 위양성(false positive)로 판정될 수 있는 어려운 경우가 있습니다. 이러한 결과는 시험실간의 또한 시험간의 측정의 차이(variation)가 나타날 수 있습니다. 결론적으로 이렇게 3가지 유형을 판단하여 CHO 세포에 의한 백일해백신의 specific toxicity test의 결과를 판정하게 됩니다.

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다음 슬라이드는 CHO 세포를 이용한 백일해백신의 specific toxicity를 판정하는 방법 중 Direct method로서 녹십자(Green cross corporation)과 식품의약품안전평가원(NIFDS, National Institute of Food and Drug Safety Evaluation)의 시험 결과를 나타내는 도표입니다. 슬라이드 상단의 초록색으로 표시된 box모양의 도표는 녹십자가 수행한 결과를 나타내며, 슬라이드 하단의 붉은색으로 표시된 box모양의 도표는 저희 Lab에서 수행한 식품의약품안전평가원의 결과를 나타냅니다. 각 도표의 직사각형 박스는 만약 모든 결과가 정상적으로 판정될 시에는 총 18개로 나타나며, 즉 3회 3반복인 9회 시험을 시험자 2명의 각각 양성으로 판정한 결과를 반영한 것입니다.

보시는 바와 같이 녹십자와 우리 Lab간의 결과의 차이가 큼을 알 수 있습니다. 먼저 녹십자의 경우 BRP pertussis reference toxin에 의한 마지막 세포응집결과가 first row, A row 또는 second row, B row에 주로 표시되었으며 이는 백일해 독소 0.05 IU/mL 또는 0.025 IU/mL에 해당되는 독소농도에서 마지막 양성반응이 보여진다는 결과입니다. 반면에 우리 Lab의 경우에는 네 번째 row, D row인 0.0062 IU/mL에 해당되는 독소농도 희석구간에서 마지막 양성반응이 보여짐을 알 수 있습니다.

(Slide 6에서 9를 차례로 보여주면서) 또한 녹십자의 경우 Vaccine type과 관계없이 모두 Aluminum adjuvant의 영향으로 모든 well이 Invalid 결과를 보였습니다. 심지어 Unspiked Vaccine의 경우에도 Invalid의 결과를 보였습니다. 반면에 우리 Lab의 경우 spiked된 toxin의 농도 의존적(dependant)으로 결과를 도출할 수 있었습니다. 물론 우리 Lab 역시 18개의 각각의 시험결과 중 다수의 Invalid 결과가 보였습니다. 그러나 우리 Lab에서 보여진 Invalid결과는 다음 슬라이드에서 보다 자세히 설명하겠지만, positive 결과는 보이지 않고 희석(dilution)하면서 백신의 aluminum adjuvant의 영향으로 인한 cell abnomality가 보이다가 negative결과가 보이는 것을 Invalid라고 표시하였습니다. 예를 들면 virus infection으로 보이는 cytopathic effect를 판정할 때 사용되는 50%의 세포변형의 순간을 판정하는 CPE50 과 같이 판정결과가 두 개이면 보다 결과변이가 적을텐데, 이처럼 abuminum에 의해 3가지의 판정결과를 가지면 상대적으로 각 시험실마다 변이가 많을 수 있는 확률이 높을 것 같습니다.

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다음 두 개의 슬라이드를 통해 Direct Method를 수행하면서 결과판정 시 어려웠었던 점을 말씀드리도록 하겠습니다. 일반적으로 백일해독소원액(bulk)에서 주로 시험하는 Direct Method인 CHO cell clustering assay는 최종원액(final bulk) 또는 완제품(final product)에서는 백신의 aluminum adjuvant에 영향으로 결과판정이 매우 힘들다는 것입니다. 첫 번째 슬라이드를 보듯이 백신을 상단 오른쪽 끝의 사진으로 나타내는 160배 희석하더라도 대부분이 aluminum adjuvant에 의한 세포독성으로 세포사멸(cell death)라던지 변형(abnomality)가 보여 양성으로 판정하기가 불가능합니다. 또한 하단 중앙 사진인 640배 희석 이후 단계에서는 reference toxin 1 IU나 2 IU의 spiking 농도에서는 대부분 음성결과를 보였습니다. 보통 I IU나 2 IU는 mouse를 이용하는 HIST assay에서 실질적으로 pass 또는 fail에 대한 판정기준을 나타낸다고 생각되어지는 독소농도 구간입니다. 세포변화를 이용한 판정에 대한 시험법은 일반적으로 양성희석구간이 넓어야만 판정이 용이한데, 이처럼 양성구간은 좁고, alumimun adjuvant에 의한 cell abnomality구간과 음성구간이 넓은 이러한 direct method시험법은 실질적인 품질검사로서는 사실상 어려운 시험법으로 생각됩니다.

백일해 백신 독성연구 번역(영어 번역본)

Now, I shall say the findings of joint research of both the Green Cross and NIFDS to give my ideas. I say my research results and some of considerations by last 2 slides.

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At first, materials and testing methods of the joint research (BSP114 Phase II) were same as those of EDQM.

Slide 3
The slide has shown condition that judges CHO cell based testing results. The first slide shows cell clustering that is positive reaction. The pertussis toxin made change of cells to do cell clustering in proportion to toxic amount.

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The slide has shown no cell clustering without pertussis toxin that is negative reaction. The cell test of 96 well plate has disadvantage of too much small sized well so that much resuspension time is needed to adhere cells on the well evenly. Enough time has not been given to prevent toxin receptor of the cells from being digested at processing of trypsin: So, even adherence of cells may be difficult.

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Lastly, vaccine’s aluminum adjuvant prevents cells from growing up to have irregular shape and to produce cell death that can be invalid. I shall say later again, and the cells have irregular shape under influence of aluminum adjuvant to produce clustering being similar to cell clustering made by pertussis toxic from time to time and to be difficult to judge result and to judge false positive. The result can be made at variation between test rooms and between measurements. You may judge results of specific toxicity test of pertussis vaccine of CHO cells by relying upon the three kinds of types.

Slide 6~ Slide 9
The slide has shown test result of not only Green Cross Corporation but also NIFDS (National Institute of Food and Drug Safety Evaluation) that is direct method of testing of specific toxicity of pertussis vaccine by using CHO cells. The diagram of green colored box at top of the slide indicates test results, and the diagram of red colored box at bottom has indicated test result of NIFDS at this laboratory. Eighteen of rectangular boxes of each diagram make appearance at normal condition to reflect test result of positive that each two inspectors have conducted test at 9 tests repeatedly three times.

As shown in the diagram, there exists much difference of test result between Green Cross Corporation and this laboratory. At first, Green Cross Corporation has indicated last cell clustering result by BRP pertussis reference toxin at first row, A row and/or second row, and B row and to show last positive reaction of toxic concentration at either 0.05 IU/mL or 0.025 IU/mL of pertussis toxic. On the other hand, this laboratory has indicated last positive reaction at the area of diluted toxic concentration that corresponds to 0.0062 IU/mL at the fourth row and D row.

(Display slide 6 to slide 9 one by one) Green Cross Corporation had invalid result of all of the wells under influence of aluminium adjuvant regardless of vaccine type. On the other hand, this laboratory had concentration dependent result of spiked toxin. Of course, this laboratory had many invalid results of 18 test results as well. Following slide shall show invalid results in this laboratory to identify invalid of negative result that cell abnormality makes appearance under influence of aluminum adjuvant to dilute without positive result. For instance, CPE50 judges two results of the time of 50% cell transformation at judgement of cytopathic effect that looks to be virus infection: As such, three kinds of test results of aluminum are much likely to transform at each laboratory.

Slide 10
I say difficulties at judgment by following two slides when making use of direct method. CHO cell clustering assay of direct method at testing of pertussis toxic bulk is very much difficult to judge result under influence of aluminum adjuvant of the vaccine of final bulk and/or final product. At 160 times dilution of photograph at the end of righthand photograph at top of the vaccine of the first slide, most of cells look to be cell death and/or abnormality at cell toxic made by aluminum adjuvant that is difficult to judge positive. At 640 times dilution of the photograph at center of the bottom, spiking concentration of reference toxin 1 IU and/or 2 IU mostly showed negative result. Either I IU or 2 IU displays judgment standard of pass and/or fail at HIST assay to be toxic concentration section. Positive dilution area shall be expanded at testing by changes of cells to judge easily, and direct method with narrow positive area and wide cell abnormality areas and negative area of aluminum adjuvant is difficult to make use of it at quality inspection.