의약품 시험방법 번역(한국어 번역)○ 시험방법
1. 성 상 : 육안으로 충전이 완료된 완제의약품을 관찰한다.
2. 무균시험 : 대한약전 일반시험법 중 무균시험법의 직접법에 따라 시행한다. 단, 검체는 완제의약품이 충전되는 마지막 배양단계 전 계대배양 시 중간엽줄기세포 5 × 104개 및 세포배양액 10 mL을 이용하고 완제의약품이 충전되기 72시간 전에 시험을 시작한다.
3. 마이코플라스마 부정시험 : 생물학적제제 기준 및 시험방법의 마이코플라스마 부정시험 및 식약청 가이드라인 “세포치료제에 적합한 마이코플라스마 부정시험법 (2008)”의 직접도말 배양법 및 증균배양법에 따라 시행한다. 다만 배지 성분, 배지량 및 검체 접종량은 생물학적제제 기준 및 시험방법에 따르고 배지 수 및 배양방법은 가이드라인을 따른다. 검체는 완제의약품이 충전되는 마지막 배양단계 전 계대배양 시 중간엽줄기세포 8 × 103개 및 세포배양액 1.6 mL을 이용하고 완제의약품이 충전되기 72시간 전에 배양을 시작한다.
4. 엔도톡신시험 : 대한약전 일반시험법의 엔도톡신시험법 중 비색법에 따라 충전된 완제의약품을 대상으로 시험한다.
5. 외래성 바이러스 부정시험 : 미국 PTC in characterization of cell lines uesd to produce biologicals (1993)의 바이러스 부정시험법에 준하는 세포병변확인법과 혈구흡착법을 시행한다.
5-1 세포병변확인법 : 아래와 같이 시험한다.
① 검체 : 완제의약품이 충전되는 마지막 배양단계 전 계대배양 시 중간엽줄기세포 1 × 105개 및 세포배양액 2 mL을 액체질소 및 37℃에서 동결 및 융해과정을 3회 반복하여 세포를 파쇄시키고 원심분리를 하여 상등액을 회수하여 시험검체로 사용한다.
② 지표 세포주 및 대조군 : 아래와 같은 지표 세포주, 양성 및 음성대조군을 사용한다.
가) 지표 세포주 (indicator cell line) : 아래와 같은 두 가지 종류의 단층배양 세포주를 이용한다.
– Human diploid lung (MRC-5) 세포주(한국세포주은행, 10171)
– African green monkey kidney (Vero) 세포주(한국세포주은행, 10081)
나) 양성대조군 : Measles 바이러스(ATCC, VR-24)
다) 음성대조군 : 10% FBS가 포함된 배양배지 (DMEM)
③ 사용장비 및 기구 : 무균작업대, 광학도립현미경, CO2 배양기, 원심분리기
④ 시험방법 : 시험방법은 다음과 같다.
가) 시험 하루 전, 지표 세포주인 MRC-5 및 Vero 세포를 12 well 플레이트에 접종하여 배양한다.
나) 배양액을 제거하고 양성대조군, 음성대조군 및 검체를 well 당 각각 0.5 mL 씩 접종하고 2시간 동안 반응시킨다.
다) 반응이 끝난 후 대조군 및 검체를 제거하고 새로운 배지 (Vero: DMEM+1% FBS, MRC-5: DMEM+2% FBS)를 1 mL씩 다시 넣어주고 배양한다.
라) 14일 이상 배양하면서 현미경으로 세포병변효과 (CPE; cytophatic effect)를 관찰한다. 단, 배양 7일째 세포병변효과가 관찰되지 않은 well은 계대배양을 실시하여 관찰한다.
⑤ 결과의 판정 : 배양기간 동안 검체를 접종한 지표 세포주에서 세포병변효과가 관찰되지 않으면 최종 완제의약품이 적합한 것으로 판정한다. |
의약품 시험방법 번역(영어 번역본)○ Experiment Method
1. Appearance : Observe the charge-completed finished medicine with the naked eye.
2. Sterility Test : Conduct according to the direct method of the sterility test in Korean Pharmacopoeia’s general test methods. However, when subculturing the test material before the last cultivation step when the finished medicine is charged, use 5 × 104 Mesenchymal stem cells and 10 mL of cell culture solution and start the test 72 hours before the finished medicine is charged.
3. Mycoplasma Test : Conduct according to biological control critera and test method’s mycoplasma test and the direct smear culture method and enrichment culture method in the Food and Drug Administration’s guideline, “Draft Guiance on the Mycoplasma Test. Suitable for Cell Therapy Products (2008)”. However, follow biological control criteria and test method for medium component, medium amount and test material injection amount, and follow the guideline for the number of medium and cultivation method. When subculturing before the last cultivation step when the finished medicine is charged, use 8 × 103 mesenchymal stem cells and 1.6 mL cell culture solution and start cultivation of test material 72 hours before the finished medicine is to be charged.
4. Endotoxin Test : Test the charged finished medicine based on the colorimetric method of endotoxin test in Korean Pharmacopoeia’s general test methods.
5. Adventitious Virus Test : Conduct the cytophatic confirmation method and hemadsorption method which are based on the virus test method of US PTC in characterization of cell lines used to produce biologicals (1993).
5-1 Cytophatic Confirmation Method : Experiment as following.
① Test material : When subculturing before the last cultivation step when the finished medicine is charged, repeat 3 times a freezing and thawing process of 1 × 105 mesenchymal cells and 2 mL cell culture solution in liquid nitrogen and 37℃ to fragmentize cells, centrifuge and retrieve the supernatant to use as test material.
② Indicator cell line and control groups : Uses indicator cell line, positive and negative cell lines as following.
A) Indicator cell line : Uses the following two types of monolayer cultured cell lines.
– Human diploid lung (MRC-5) cell line(Korean Cell Line Bank, 10171)
– African green monkey kidney (Vero) cell line(Korean Cell Line Bank, 10081)
B) Positive control group : Measles virus(ATCC, VR-24)
C) Negative control group : Culture medium (DMEM) containing 10% FBS
③ Equipments : Clean bench, optical inverted microscope, CO2 incubator, centrifuge
④ Method : The experiment method is as following.
A) A day before the test, inject MRC-5 and Vero cells, which are index cell strains, into a 12-well plate and cultivate.
B) Remove the culture medium and respectively inject 0.5mL of positive control group, negative control group, and the test material per well and react for 2 hours.
C) After reaction is completed, remove the control group and test material and respectively put in 1mL of new culture medium (Vero: DMEM+1% FBS, MRC-5: DMEM+2% FBS) and cultivate.
D) While cultivating for more than 14 days, observe the cytophatic effect (CPE) with the microscope. If a well does not have cytophatic effect observed for 7 days, conduct subculture and observe.
⑤ Result Evaluation : Evalute the final finished medicine as suitable if cytophatic effect was not observed during the cultivation period in the index cell strains injected with the test material. |
