인플루엔자 연구논문 번역(한국어 원본)인플루엔자 바이러스는 연간 세계 인구의 15%를 감염시키고 500,000명의 죽음을 야기하는 바이러스다. 이 바이러스의 주항원은 헤마글루티닌(HA)으로 인플루엔자 백신의 역가는 HA의 함량을 기준으로 한다. single radial immunodiffusion(SRID) 방법은 매우 specific하고 백신의 HA함량을 시각적으로 측정할 수 있는 현재 유일한 방법이지만, 시간이 오래 걸리고 처리량에 비하여 매우 노동 집약적이며, sensitivity, accuracy, precision이 비교적 떨어진다는 단점이 있다. 또한 이 방법에서 사용되는 표준항원과 표준항체를 개발하는 데에 2∼3개월이 소요되기 때문에 대유행과 같은 특수한 상황에서 신속한 백신 개발에 걸림돌이 되기도 한다. 따라서 이 방법을 대체할 수 있는 새로운 분석법 개발이 요구된다. 이번 연구에서 확립된 시험법은 분석이 간단하면서도 빠르고, 표준항체가 필요하지 않기 때문에 신속한 백신 개발에 큰 도움이 될 수 있다. 이번 연구에서는 인플루엔자 바이러스 표준항원인 HA가 trypsin 등 효소처리에 의해서 single disulfide bridge로만 연결되어있는 HA1, HA2 두 subunit으로 분해될 수 있으며, 환원반응을 통해 disulfide bridge가 분해되고 쉽게 HA1과 HA2가 분리된다는 사실에 근거를 두고, reverse phase(RP)-HPLC을 이용하여 분리된 HA1 peak 면적을 통해 인플루엔자 백신 중 HA함량을 구하고자 하였다. 먼저 trypsin전처리 조건을 확립하였고, 확립된 전처리조건에 따라 전처리 후 HPLC분석을 수행하고자 하였다. 분석조건 중 이동상의 gradient 조건을 확립하기 위하여 여러 번의 시행착오를 거쳐 표준항원과 백신단가원액에서 약 12분대의 HA1 peak를 분리할 수 있었다. 분석법의 밸리데이션을 위하여 각각 특이성, 직선성, 정확성, 정밀성, 검출한계 및 정량한계를 측정하였다. 그 결과를 볼 때, HA함량에 따른 HA1 피크면적에서 상관계수가 0.99이상으로 우수한 직선성을 나타내었다. 정확성, 정밀성도 각각 회수율로서 93.1∼98.7%를 나타내었고, 6번 전처리 및 분석 후 피크면적과 피크유지시간에 대한 상대표준편차값이 3%이하를 나타내어 훌륭한 정밀성을 나타내었다. 확립된 시험법에 따라 인플루엔자 표준항원의 HA함량으로 검량선을 작성한 뒤 계절백신단가원액 (seasonal influenza monovalent bulk vaccine) 12로트의 HA 함량을 측정한 결과, 계절백신단가원액의 HA 함량은 SRID로 측정한 결과와 밀접한 상관관계를 나타내었다. 이번 연구결과로 확립된 시험법을 실제 백신 생산현장에서 적용하는 과정을 통해 개선점을 보완하고, 광범위한 모니터링을 통해 시험법에 대한 신뢰성을 확립한다면, 표준항체를 사용할 수 없거나 SRID법을 수행하기 어려운 경우, 인플루엔자 백신 중 HA 함량측정에 이용될 수 있을 것으로 사료된다.
인플루엔자는 계절적 유행성을 가지는 감염병이며 건강한 사람에게 있어서도 일상생활에 큰 지장을 초래하는 바이러스성 질환이다. 인플루엔자 백신은 인플루엔자의 예방을 위해 가장 효과적이면서도 확실한 방법이다. 대부분의 백신들은 한가지의 병원체를 사용하여 백신을 제조하며 일생동안 일정한 간격을 두고 1-5회 접종한다. 그러나 인플루엔자는 유행주가 거의 매년 바뀌기 때문에 백신에 포함되는 바이러스주가 거의 매년 바뀌며, 인플루엔자는 거의 매년 항원의 소변이가 일어나서 매년 인플루엔자의 유행이 일어나지만, 10-40년을 주기로 항원의 대변이 (antigenic shift)가 일어나서 세계적인 범유행이 발생하면 전 세계적으로 수천만명의 사망을 초래할 수 있다(1).
인플루엔자 바이러스의 비리온 (virion)구조는 가장 바깥쪽에 이중 지방층으로 이루어진 외피(envelop)가 있고, 여기에 2개의 표면 당단백질(glycoprotein)이 돌출되어 있는데 하나는 기둥모양의 혈구응집소인 헤마글루티닌(haemagglutinin, HA)이고, 다른 하나는 버섯모양의 뉴라민분해효소인 뉴라미니다제(neuraminidase, NA)이다. HA는 인플루엔자 바이러스
가 숙주 세포막에 결합하여 세포내로 도입되는 과정에 이용되고 적혈구의 응집반응을 유발할 수 있어 바이러스 검출과 항체가 측정에 이용된다. NA는 세포표면에 존재하는 바이러스의 수용체인 sialic acid를 절단하는 역할을 하며 바이러스가 숙주세포에서 효과적으로 방출되는 과정에 이용된다(2-5).
인플루엔자 백신의 주항원은 인플루엔자 바이러스 외피에 있는 HA이며 백신의 역가 또한 HA 함량을 기준으로 한다. 현재, 인플루엔자 백신의 HA 함량을 측정하기 위해서 유럽약전과 WHO에서 추천하는 방사면역확산법 (Single Radial Immunodiffusion technique, SRID)이 국내･외에서 공통적으로 사용되고 있다(6). SRID를 이용한 HA 함량 측정 시 NIBSC (The National Institute for Biological Standards and Control) 등에서 분양하는 표준항원과 표준항체가 사용되는데, 인플루엔자 백신 항원과 표준항체가 응집된 환(環)의 크기를 표준항원과 표준항체가 응집된 환의 크기와 비교･환산함으로써 인플루엔자 백신의 HA 함량을 측정한다. SRID법은 매우 specific 하고, 고난도의 기술을 요구하지 않으며, European Pharmacopoeia Commission으로부터 인정받은 시험법으로서 백신의 항원함량을 시각적으로 측정할 수 있는 현재 유일한 방법이나, 샘플을 처리하는데 24시간 이상 소요되고, 대부분의 공정이 수작업으로 이루어져 처리량에 비하여 대단히 노동 집약적이며, 또한 sensitivity, accuracy, precision이 비교적 떨어진다는 단점이 있다 (7). 또한 인플루엔자 판데믹 상황에 대처하기 위한 백신 개발 시 그 함량 측정 또한 신속하게 이루어져야 할 것이다. 우리나라에서는 2009년도에 예기치 않은 H1N1 인플루엔자 대유행 상황에서 세계보건기구(World Health Organization, WHO)의 표준항원 공급 지연으로 백신제조 및 후속 임상시험이 전반적으로 지연된 경험을 하였다. 즉, SRID시험에 사용되는 표준항원과 표준항체 개발에 2∼3개월이 소요되기 때문에 신속한 백신개발에 걸림돌이 되었다 (8-9). SRID법을 이용한 HA 함량 측정 시 사용되는 표준항원 및 표준항체 개발에 많은 시간이 소요되므로, 판데믹 상황과 같이 신속하게 백신이 개발되어야 할 경우 SRID시험법 이외에 신속한 HA함량 측정법이 요구된다. 이에 최근 High Performance Liquid Chromatography (HPLC)등을 이용한 물리화학적 시험방법에 의한 인플루엔자 백신 중 HA함량 측정시험법 연구가 활발하게 진행되고 있다(10-12). 본 연구에서는 trimeric HA가 trypsin 등 효소처리에 의해서 single disulfide bridge로만 연결되어있는 HA1, HA2 두 subunit으로 분해될 수 있으며(13-14), 환원반응을 통해 disulfide bridge가 분해되고 쉽게 HA1과 HA2로 분리된다는 사실에 기초하여, HA1 피크의 면적으로 헤마글루티닌 함량을 측정한 기존의 연구결과를 기초로 하였으나 세부조건을 변경하여 시험법을 확립하였다. 이를 이용해 계절인플루엔자 백신 단가원액 12롯트에 대해 측정한 헤마글루티닌 함량과 표준시험법인 SRID시험결과를 비교하여 상관관계를 도출하였다. |
인플루엔자 연구논문 번역(영어 번역본)Influenza virus infects 15% of the world’s population, causing 500,000 deaths yearly. The main antigen of the virus is haemagglutinin (HA), and the potency of influenza vaccine is based on the HA content. Single radial immunodiffusion (SRID) is greatly specific and currently the only method of visual measurement of vaccine’s HA content, but it takes a long time, is greatly labor-intensive, and has relatively low sensitivity, accuracy, and precision. The fact that standard antigen and antibody used for this method takes two or three months to be developed may serve as an obstacle in rapid developing vaccine in specific situation such as influenza pandemic, thus requiring developing a new method of analysis to supersede the method. The test method established in this study may greatly contribute to rapid development of vaccine because it enables simple and quick analysis without standard antibody. We identified the HA content in influenza vaccine from the isolated HA1 peak by using reverse phase (RP)-HPLC, given that HA as the standard antigen of influenza virus can be decomposed by enzyme process into two subunit, HA 1 and HA 2, that are connected only by single disulfide bridge and that the disulfide bridge can be decomposed by reduction response and HA1 and HA2 can be isolated easily. After establishing trypsin preprocessing conditions, we performed the preprocessing based on the established terms and HPLC analysis. In order to establish gradient condition of mobile phase among analysis terms, we could isolate HA1 peak with around at 12 minutes period from the standard antigen and the influenza monovalent bulk vaccine. For validation of the analysis method, we measured specificity, linearity, accuracy, precision, limit of detection, and limit of quantitation, respectively. As a result, there was superior linearity at HA1 peak area based on the HA content, with 0.99 of correlation coefficient. Accuracy and precision were between 93.1 and 98.7% as recovery, and superior precision was shown as relative standard deviation was 3% and under for peak area and peak retention time after six times of preprocessing and analysis. We drew up calibration curve from the HA content of standard antigen of influenza based on the established test method and measured the HA content of the 12 rots of seasonal influenza monovalent bulk vaccine. The HA content of the bulk vaccine showed close correlation to the measurements by the SRID. If what should be improved is compensated via application to actual production of vaccine and reliability is identified via wide-ranged monitoring, the test method established by the results of this study may be used to measure HA content of influenza vaccine when standard antibody cannot be used or the SRID is hard to be conducted.
1. Introduction
Influenza is an infectious disease with seasonal epidemicity and a viral disease that can cause even healthy people inconvenience in their daily life. Influenza vaccine is the most effective and definite method to prevent influenza. In most cases vaccine is produced by using one pathogen and is inoculated one to five times in one’s life at regular intervals. As for influenza, however, the viral strain contained in vaccine is changed almost every year as the epidemic strain is changed almost every year. Influenza is epidemic every year because of antigenic drift almost every year, but may cause tens of millions of death around the world in case of antigenic shift over a period of 10 to 40 years(1).
The virion of influenza virus has envelope with outermost dual adipose layers where two surface glycoproteins are protruded: the column-shaped haemagglutinin (HA) and the mushroom-shaped neuraminidase (NA The HA is used when the influenza virus is bonded to host membrane to be entered within the cell and is used to detect virus and measure antibody because it can induce agglutination reaction of eythrocytes. NA plays a role in cutting sialic acid as a receptor of virus on cell surface, being used in effective emission of virus from the host cell(2-5).
The main antigen of influenza vaccine is the HA on the outer virus, and the potency of the vaccine is based on the HA content. As of today, the Single Radial Immunodiffusion technique (SRID) recommended by the European Pharmacopoeia and the WHO is used to measure the HA content of vaccine domestically and abroadly(6). On measuring the HA content by using the SRID, the standard antigen and the standard antibody obtained from the National Institute for Biological Standards and Control (NIBSC) are used: the HA content was measured by comparing and converting the size of rings that the antigen of influenza vaccine and the standard antibody were agglutinated and that of agglutination of the standard antigen and the standard antibody. The SRID method is greatly specific, does not need difficult techniques, and serves as the only method to visually measure the content of antigen in vaccine approved by the European Pharmacopoeia Commission. However, it takes at least 24 hours to treat samples, is greatly labor-intensive because most processes are done manually, and has relatively low sensitivity, accuracy, and precision(7). The HA content in vaccine should be rapidly measured when vaccine is developed to handle influenza pandemic. In Korea, the production and follow-up clinical tests for vaccine were generally postponed because of delay in supplying the standard antigen by the World Health Organization (WHO) in the H1N1 influenza pandemic in 2009. In other words, rapid development of vaccine was disturbed because developing the standard antigen and antibody for the SRID test required two or three months(8-9). Because the standard antigen and antibody used for measuring the HA content using the SRID need a long time in developing, a rapid method to measure the HA content other than the SRID when vaccine should be quickly developed in, for example, influenza pandemic. In this context, there are recent researches of testing methods to measure the HA content in influenza vaccine physicochemically by using the High Performance Liquid Chromatography (HPLC) (10-12). Based on that trimeric HA may be separated into two subunits as HA1 and HA2 that are connected only by single disulfide bridge by enzyme process such as trypsin(13-14) and that the disulfide bridge can be decomposed by reduction response and HA1 and HA2 can be isolated easily, we in this study established test method based on the existing results of studies measuring HA from the HA1 peak area but changed the detailed terms. By using the method, we identified correlation by comparison the HA content measured of 12 rots of seasonal influenza monovalent bulk vaccine with the results of the SRID as the standard method. |
