세포 배양과 세포 노화 번역(영어 원본)C. Research Procedure
Cell Culture: On the first day of the research, a frozen vial of P2 human ADSCs (kind gifts from Stem Cell Laboratoy, Bundang CHA Hosptial, Bundang, Korea) was slowly thawed by dipping into water (36℃) for 5 minutes. Then half of the content was transferred to a 10ml test tube containing 5ml of DMEM (Gibco) supplemented with 10% FBS (Invitrogen) and 1mm NEAA(Gibco), and the other remaining half into another 10ml tube containing 5ml DMEM supplemented with 10% HS (acquired from Bundang CHA Hospital) and 1mm NEAA. The tubes were than centrifuged at 900rpm for 3 minutes to sediment floating single cells. After 3 minutes, supernatant was carefully aspirated using a pipette and resuspended with the corresponding media (10ml). Then, 10㎕ of the suspension was placed onto a hemocytomer and cells in 4 grids were counted. The total cell number was added up and divided by 4 to give an average number of cells in one grid. Then the number was multiplied by 10,000 as each grid represents 10,000 cells per ml. The number was then multiplied by 10 to give a total number of cells in 10ml suspension. Using a simple ratio calculation method, a volume of suspension that contains 50,000 was calculated and plated in each well of a 6-well plate for the growth curve experiment. For PCR, the same number of cells was plated in a 60mm culture dish. For flow cytometry, 100,000 cells were plated in a 100mm culture dish and cultured for 5 days. The culture medium was changed daily and the same procedure was repeated for HFs (purchased from BD Science).
Growth curve: In order to compare proliferative capacity of the cells in two different sera, cells from one well of the 6 well plate were counted daily until day 5 post transplantation. To do this, media was aspirated and cells were rinsed with 3ml PBS. PBS was aspirated and the cells were incubated with 3ml Trypsin (Gibco) at 36℃ for 3 minutes. At the end of trypsin incubation, cells were detached from the surface and were observed to be floating in the enzyme. The floating cells were then transferred to a 50ml and quenched with 7ml growth medium. The mixture was then centrifuged at 900rpm for 3 minutes. The supernatant was aspirated and the pallete was resuspended with 10ml fresh growth media to count the cells in the same way as previously described above.
Flow cytometry: Cells cultured in a 100mm culture dish was briefly rinsed with 3ml PBS before incubating with 3ml trypsin for 3 minutes at 36℃. The detached cells were then transferred to a 50ml test tube and quenched with 7ml fresh growth medium. The cells were then centrifuged at 900 rpm for 3 minutes before discarding supernatant. The left over pallete was then resuspended with 5ml PBS and were forced through a filter to only separate single cells from clumps. The filtered cells were then incubated with Propidium iodide (PI, Invitrogen) for 3 minutes before analyzing with FACs machine. Non stained sample was used as a negative control to set up a quadrant that delineates the PI-negative cell popluation.
RNA extration: Cells cultured for 6 days on a 60mm culture dish were detached as previously described using Trypsin. The cell palletes were than resuspended in 1ml Trizol (Invitrogen) and incubated at room temperature for 5 minutes. Then 200ul chloroform (Sigma) was added to the cells and vigorously shaken for 15 seconds. The sample was then centrifuged at 13000rpm for 15 minutes at 4℃. 500ul supernatant was transferred to a new tube and the equal volume of isopropanol (Sigma) was added and incubated at room temperature for 10 minutes. The sample was then centrifuged at 12000rpm for 10 minutes at 4℃ after which RNA pallete was visible at the bottom of the tube. The pallete was resuspended with 75% ethanol and centrifuged at 7500rpm for 5 minutes at 4℃. The supernatant was removed and the sample was briefly air dried until the pallete became transparent. The pallete was then dissolved in 40ul RNase free water. The concentration of RNA was measured using Nanodrop (blah).
cDNA synthesis and Real Time Polymerase Chain Reaction (RT-PCR): For cDNA synthesis, Maxime RT premix (Oligo dT primer) was purchased from Intron. 1ug of RNA sample was added to the premix tube which was exposed to 45℃ for 60 minutes followed by 95℃ for 5 minutes in a PCR machine. To amplify our genes of interest, we performed RT-PCR. 1ul cDNA was transferred to a Pre-Aliquoted Ready Mix PCR mastermix tube (KisanBio). The mastermix contains all the components required for performing RT-PCR such as DNA polymerase, MgCl2, dATP, dCTP, dGTP and dTTP. Also added to the mastermix tube were 1ul Collagen Type I, III and a housekeeping gene GAPDH forward and reverse primers and 10.5ul distilled water. The mixture was then exposed to 1) 95℃ for 2.5 minutes for denaturation, 2) 55℃ for 45 seconds for annealing, 3) 72℃ for 1 minute for elongation and finally to 72℃ for 10 minutes for final extension. This cycle was repeated for 35 times.
Electrophoresis: Approximately 0.6g of the agarose powder was weighed and dissolved in 40ml 1X TAE buffer in a glass flask. The mixture was swirl to ensure that the powder was homogenously distributed. Then the mixture was heated in a microwave until the solution began to boil. The flask was swirled again to make sure that the powder dissolved completely. While the flask was left to cool down, the gel chamber was filled with 1X TAE buffer up to half way. The cooled down solution was then slowly poured into the gel tray that had a comb firmly fixed. When the solution solidified, the comb was removed and the gel was placed in the chamber that was filled with 1X TAE buffer. Then 5ul of amplified genes was loaded into a well along with the DNA ladder and the gel was run at 100V for 30 minutes. The gel was then transferred to an x-ray machine to visualize the bands (GE Healthcare). |
세포 배양과 세포 노화 번역(한국어 번역본)C. 연구 절차
세포 배양: 연구 첫째 날, P2 사람 ADSCs (대한민국, 분당 차병원 줄기세포 연구소 기증)의 냉동 바이알을 물 (36℃)에 5분간 담가 천천히 해동시켰다. 그리고 내용물의 절반을 10% FBS (Invitrogen)가 혼합된 DMEM (Gibco) 5ml가 들어 있는 10ml의 테스트 튜브로 옮기고, 나머지 절반은 10% HS (분당 차병원에서 입수)와 1mm NEAA가 혼합된 DMEM 5ml가 들어있는 또 다른 10ml 튜브로 옮겼다. 튜브를 900rpm에서 3분 간 원심분리해 떠있는 단세포를 침전시켰다. 3분 후, 피펫을 이용해 상청액을 신중하게 빨아내고 해당 배지 (10ml)로 재부유시켰다. 그런 후 10㎕의 상청액을 hemocytomer에 두고 4개의 그리드에서 세포를 측정하였다. 총 세포수를 더하고 4로 나누어 하나의 그리드에 있는 평균 세포수를 구하였다. 각각의 그리드는 ml 당 10,000개의 세포를 나타내기 때문에 그 수에 10,000을 곱하였다. 그러고 나서 10을 곱해 10 ml 상청액에 있는 세포의 총수를 구하였다. 간단한 비율 계산법을 이용해 50,000개가 들어 있는 상충액의 부피를 계산하였고, 생장곡선 실험을 위해 6-웰 플레이트의 각 웰에서 평판 배양하였다. PCR의 경우에는 동일한 수의 세포를 60mm 배양 접시에서 평판 배양하였다. 유세포 분석을 위해 100,000개의 세포를 100mm 배양 접시에서 5일 간 평판 배양하였다. 배양배지는 매일 교체하였으며, HFs (BD Science에서 구매)의 경우에는 동일한 절차를 반복하였다.
생장곡선: 상이한 두 개의 혈청에서의 세포 증식능을 비교하기 위해 6개의 웰 플레이트 가운데 하나의 웰에서 세포 이식 후 5일 동안 매일 세포를 측정하였다. `이를 위해 배지를 빨아내고 3ml PBS로 세포를 세척하였다. PBS를 빨아내고 세포를 3ml 트립신 (Gibco)으로 36℃에서 3분간 배양하였다. 트립신 배양이 끝난 뒤 세포를 표면에서 분리시키고 효소에 부유시켜 관찰하였다. 그런 뒤 부유 세포를 500ml의 성장배지로 옮기고 700ml 성장배지로 quenching하였다. 그러고 나서 혼합물을 900rpm에서 3분간 원심분리하였다. 상청액을 빨아들이고 10ml의 새로운 성장배지로 플레이트를 재부유시켜 앞서 설명한 것과 동일한 방법으로 세포를 측정하였다.
유세포 분석: 3ml 트립신으로 3분 간 36℃에서 배양하기 전에 100 mm 배양 접시에서 배양된 세포를 3ml PBS로 대충 세척하였다. 분리시킨 세포를 500 ml 테스트 튜브로 옮기고 7 ml의 새로운 성장배지로 quenching하였다. 상청액을 버리기 전에 900 rmp에서 3분간 세포를 원심분리하였다. 그런 뒤 플레이트에 남아있는 것을 5ml PBS로 재부유시키고 세포 덩어리에서 필터를 통해 단일세포를 강제 분리시켰다. FACs 장치로 분석을 하기 전에 여과된 세포를 Propidium iodide (PI, Invitrogen)로 3분 간 배양하였다. 염색하지 않은 표본을 음성 대조군으로 이용해 PI 음성 세포군을 나타내는 사분면을 설정하였다.
RNA 추출: 60mm 배양 접시에서 6일 동안 배양된 세포를 트립신을 이용해 앞서 설명한 바와 같이 분리하였다. 세포 팰릿(pallet)을 1ml 트리졸 (Invitrogen)에서 재부유시키고 5분 간 실온에서 배양하였다. 그러고 나서 200ul 클로로포름 (Sigma)을 세포에 첨가하고 15초 동안 세계 흔들었다. 그런 뒤 표본을 15분 동안 13000rpm에서 원심분리하였다. 500ul 상청액을 새로운 튜브로 옮기고 동일한 양의 이소프로판올 (Sigma)을 첨가한 뒤 10분 간 실온에서 배양하였다. RNA 팰릿이 튜브 바닥에 나타난 후 4℃에서 표본을 12000rpm로 10분 간 원심분리하였다. 팰릿을 75% 에탄올로 재부유시키고 4℃에서 5분 동안 7500rpm으로 원심분리하였다. 상청액을 제거하고 팰릿이 투명해 질때까지 표본을 공기 건조시켰다. 그러고 나서 400ul RNas free water로 플랫을 용해시켰다. Nanodrop (blah)을 이용해 RNA 농도를 측정하였다.
cDNA 합성과 실시간 중합효소 연쇄반응 (RT-PCR): cDNA 합성을 위해 Intron에서 Maxime RT premix (Oligo Dt primer)를 구입하였다. 1ug의 RNA 표본을 PCR 장치에서 60분 동안 45℃에 노출시킨 후 95℃에서 5분 간 노출시킨 premix에 첨가하였다. 대상이 되는 유전자를 증폭시키기 위해 RT-PCR을 실시하였다. 1ul cDNA를 Pre-Aliquoted Ready Mix PCR mastermix 튜브 (KisanBio)로 옮겼다. mastermix에는 DNA 중합효소, MgCl2, dATP, dCTP, dGTP, dTTP와 같이 RT-PRC을 실행하는데 필요한 모든 성분들이 들어 있다. mastermix 튜브에 1ul 콜라겐 유형 Ⅰ, Ⅲ과 관리유전자 GAPDH 정방향 프라이머와 역방향 프라이머, 10.5ul의 희석수를 첨가하였다. 그러고 나서 혼합물을 1) 변성시키기 위해 95℃에서 2분 간 2) annealing하기 위해 45분 동안 55℃에서 3) 신장을 위해 72℃에서 1분 간 마지막으로 최종 연장을 위해 72℃에서 10분 간 노출시켰다. 이러한 사이클을 35회 반복하였다.
전기영동: 약 0.6g의 agarose 분말을 혼합하고 유리플라스크에서 40ml 1X TAE 완충액으로 용해시켰다. 분말이 균질하게 분포되도록 혼합물을 와류시켰다. 그러고 나서 용액이 끓기 시작할 때까지 전자레인지로 혼합물을 가열하였다. 분말이 완전히 용해되도록 플라스크를 다시 와류시켰다. 플라스크가 식는 동안 겔 챔버를 1X TAE 완충액으로 중간까지 채웠다. 그런 뒤 Comb가 단단하게 고정되어 있는 겔 트레이에 식은 용액을 천천히 따라 부었다. 용액이 응고되자 comb를 제거하고 겔을 1X TAE 완충액으로 채워진 챔버에 넣었다. 그러고 나서 DNA 사다리를 따라 5ul의 증폭된 유전자를 웰에 부착시키고 100V에서 30분 동안 running 하였다. 그런 뒤 겔을 x-레이기로 옮기고 밴드를 시각화하였다 (GE Healthcare). |
